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1、目 录细胞培养2组织总RNA提取4RNA逆转录7普通PCR8胶回收9RT-PCR10同步RNA提取蛋白12蛋白提取13蛋白浓度测定13Western Blot配液14Western Blot步骤15Chip（染色质免疫共沉淀）17细胞培养试剂及仪器PBS（4保存）、培养基（4保存）、0.25% 胰蛋白酶（20保存）、胎牛血清（20保存）、封口膜、无菌枪头（白、蓝）、试管（10ml）、EP管盒、培养瓶、口罩、手套、帽子、培养皿（培养细胞和分离组织）、离心管、冻存管、过滤器、注射器、超净工作台、CO2培养箱（5%，维持PH值）、普通冰箱（培养用液、临时用血清、消化液）、-20冰箱（血清、酶类、抗体
2、、药品）、离心机（沉淀细胞）、电热鼓风干燥箱（烘干、灭菌）、压力蒸气消毒器、恒温水浴箱（5630 min，灭活血清中的抗体）、倒置显微镜（观察细胞状态）、普通显微镜（细胞计数）、电子称、液氮灌。仪器处理及试剂配制1、 123 C高压灭菌30min（枪头、试管），然后放入电热鼓风干燥箱烘干过夜。2、 培养基内加入10%胎牛血清。3、 培养基中加入1%双抗。4、 瓶口、瓶盖、镊子等使用前、使用后要在酒精灯上过火。注意事项1、 实验前检查培养箱温度和CO2浓度。2、 检查CO2瓶压力和剩余量。3、 临走时请确认关闭倒置显微镜。4、 血清可中和胰蛋白酶。5、 所有离心操作要用封口膜封口。操作步骤组织细
3、胞取材1、 常规处死动物（小白鼠断椎、大鼠吸入乙醚、兔子空气栓塞）。2、 浸泡在75% 酒精中。3、 解剖动物，用剪刀剪开皮肤，换一把剪刀取组织（取软骨保持其关节腔完整，周围带有软组织）。4、 组织放入超净工作台。5、 PBS洗涤 23 次。6、 换一把小剪刀，解剖出软骨组织（髋关节软骨帽）。7、 用剪刀剪碎至 1 mm3 左右。8、 加入0.25% 胰蛋白酶（56倍量）。9、 放入37水浴锅内或培养箱中消化（消化过程中间歇摇晃）。10、 待组织块疏松、色变白。11、 100目孔径过滤器过滤。12、 滤液移入离心管。13、 离心管用封口膜封口。14、 离心 8001000 rpm5 min。（
4、平衡、盖离心机盖子）15、 弃去上清液。16、 加入培养液。17、 细胞计数。18、 稀释至50万/ml。19、 移入培养瓶。20、 瓶口喷75% 酒精消毒。21、 确认培养瓶盖已拧松。22、 放入CO2培养箱培养。23、 24h后倒置显微镜下观察细胞贴壁情况。细胞换液与传代1、 查看酒精棉球是否够用。2、 75%酒精擦拭超净工作台。3、 准备封口膜和废液缸放入超净工作台。4、 从20冰箱中取出胰酶，放在培养箱中融化。5、 取出PBS、培养基放在超净工作台。6、 打开超净工作台紫外灯，照射 30 min 60 min。7、 打开细胞房紫外灯，照射 30 min 60 min。8、 关闭细胞房紫
5、外灯。9、 关闭超净工作台紫外灯。10、 打开超净工作台照明灯，打开抽风。11、 点燃酒精灯。12、 75% 酒精擦拭倒置显微镜。13、 取出培养瓶，拧开盖后直接倒去培养基。14、 取PBS液 1 ml洗后倾去。15、 加入胰蛋白酶 1 ml，放回培养箱中消化 10 min。16、 加入 9 ml培养基。17、 用1ml吸力吹打细胞。18、 分装入两个新的培养瓶，拧上盖子。19、 倒置显微镜观察细胞。20、 瓶口75% 酒精喷雾消毒。21、 放回培养箱（盖子不要盖紧）。22、 收拾工作台，处理废物。超超净工作台紫外灯消毒 30 min。23、 确认倒置显微镜已关闭。 种板与加药、固定1、 30
6、0l每片。2、 培养箱中温育约5 min。3、 加5 ml培养基。冻存与解冻1、 取冻存管。2、 DMSO。组织总RNA提取准备工作试剂及仪器DEPC水、瓶子（100 ml）、封口膜、滤纸（一张+N条）、Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇、无RNA酶枪头（蓝、黄）、无RNA酶EP管（1.5 ml）、EP管盒、PCR管、眼科剪、镊子、匀浆机、口罩、手套、帽子。仪器处理及试剂配制1、180 烤箱烘烤6小时：瓶子（100 ml）、眼科剪、镊子2、提前一天进行编号转换并对两套EP管提前编号。3、剪封口膜。4、剪滤纸，并在紫外灯下照射。5、临时配制75%乙醇：按每个样本 1 ml2 次=2 ml 算（
7、1 体积DEPC水 + 3 体积无水乙醇）。注意事项1、 Trizol有毒，注意自我保护。2、 在75% 乙醇中，RNA在 4至少保存1周，20至少保存1年。3、 注意环境要求流动性小，人员少。4、 最后加DEPC水溶解前，可将DEPC水先放在60温箱中温育，可加速溶解。5、 匀浆机最多可同时匀24管，离心机最多可离30管。操作步骤一、提抽（一）组织抽提1、组织从 80 冰箱中取出待溶解。2、取组织 50 mg于EP管（1.5 ml）中。3、加珠子 810 粒。4、加入 Trizol：200l。5、封口膜封闭EP管。6、置于匀浆机中（速度5，时间4 min，4 ）。7、取出后观察是否充分匀浆，
8、如未充分匀浆，继续置于匀浆机中匀浆。8、去除封口膜，再加入 Trizol：800l。（Trizol：200l + 800l = 1 ml）9、室温静置 10 min（15 30 ）。（二）细胞抽提1、倒掉培养基，PBS洗，直接将1 ml Trizol 注入培养瓶（510610106），细胞刮子刮碎细胞。2、或转入冻存管中冻存或直接进入分相操作（第 10 步）。二、分相10、在装有裂解物的EP管中加入 200l 氯仿（为Trizol总体积的 1/5）。11、剧烈振荡 30 秒。12、冰上静置 10 min（关键）。13、离心：12000 rpm15 min，4 （离心机盖盖子）。 分相为三层 上
9、层：RNA（约为Trizol的 60%）； 水相层中间：DNA；下层：蛋白质(酚-氯仿)。 有机相14、小心吸取上清液，转移至另一 EP 管中200l 2次（或150l 170l 3 次）。1ml裂解物产生的上清液体积约为 400l（或400l 600l）。有机相和中间层含有DNA和蛋白质，避免触及，宁少勿多。三、RNA沉淀15、加入与上清液等体积的异丙醇（约 400 l）。.16、颠倒混匀。17、室温下静置 10 min（20 30 ）。（开烤箱至60 ，为第 30 步做准备）18、离心：12000 rpm10 min，4 （离心机盖盖子）。19、小心弃去上清液（直接倒去上清液），避免振动R
10、NA沉淀。（RNA沉淀在EP管底的侧面形成，乳白色）四、RNA清洗（清洗两次，去离子/盐）20、离心管加入1 ml 预冷的 75% 乙醇（1 mlTrizol至少加 1 ml乙醇清洗DNA）。21、弹起RNA，使沉淀振荡起来。22、室温 9500 rpm5 min，4（离心机盖盖子）。23、小心弃去上清液（直接倒去上清液），避免振动RNA沉淀。24、离心管加入1 ml 预冷的 75% 乙醇（ 1 ml Trizol至少加 1 ml乙醇清洗DNA ）。25、弹起RNA，使沉淀振荡起来。26、室温 9500 rpm5 min，4（离心机盖盖子）。27、小心弃去上清液（直接倒去上清液），避免振动RN
11、A沉淀。28、倒置于滤纸上，并用滤纸吸乙醇，放置 5 min（ 10 min，不可过干）。29、加适量DEPC水 50l（ 25l 200l ），保证RNA浓度 1g/l。30、温箱中60温育 5 min，混匀。31、拿出后置于冰上。（或置于80冰箱中）五、测RNA浓度和纯度取1l样本在光度计上测量。OD260 代表RNA的OD值，OD280 代表蛋白质的OD值。OD260/OD280： 1.8 蛋白质污染 1.82.0 理想范围 2.0 RNA降解六、调整RNA浓度测得浓度（单位为：ng/l），加DEPC水调至相同浓度。取总RNA量为1000 ng（即1g），逆转录过程中去除基因组DNA时变
12、为总体积10l。 1000ng/测得的浓度=应取RNA液的体积（保留至小数点后两位） 7lRNA液体积=应加水的体积（保留至小数点后两位）应取RNA液的体积、应加水的体积均加入PCR管中，用于逆转录RNA逆转录准备工作试剂及仪器逆转录试剂盒、PCR管、无RNA酶枪头。仪器处理及试剂配制注意事项操作步骤1、 基因组DNA的去除反应逆转录反应体系（20l）试 剂使用量 (l)5g DNA Eraser buffer2lg DNA Eraser1lTotal RNA7lTotal volume10.0反应条件42 2min（或者室温5 min）42、 反转录反应逆转录反应体系（20l）试 剂使用量 (l)5 primescript buffer 24.0Primescript RT Enzyme Mix 11.0RT Pimer mix1.0上一步的反应液10Rnase Free dH2O4.0Total volume20.0反应条件37 15min85 5s4 （或-20长期保存）普通PCR试剂及仪器与实时定量的试剂可以共用，但不需要ROX，将0.4 l换成水即可。步骤配胶：每一小块胶（1/4方格）需15 ml左右，浓度1%3%均可（每15ml加琼脂粉0.15g0.45g），浓度越高，跑胶时间越长，相对较好。Loading Buffer:PCR产物=1:46，
