高等植物叶绿素降解的途径

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1、高等植物叶绿素降解的Pa O途径田风霞1，王玮 2,1 南阳师范学院生命科学学院，河南南阳 473061；2 作物生物学国家重点实验室/山东农业大 学生命科学学院，山东泰安 271018摘 要：文章介绍植物体内叶绿素降解PAO途径研究进展。关键词：叶绿素降解；滞绿突变；衰老PaO passway of chlorophyll breakdown in higher plantsTIAN Feng-Xia1, ZANG Jian-Lei1, WANG Wei2,*1College of Life Sciences, Nanyang Normal University, Nanyang, 4730

2、61, China; 2State Key Laboratory of Crop Science/College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Tai an, 271018, ChinaAbstract: This paper introduced the research progress of PAO passway of chlorophyll breakdown in higher plants.Keywords: Chlorophyll degradation; Stay-green Mutant; Senes

3、cence叶绿素(Chi)，地球上最丰富的色素，是用于吸收光能进行光合作用的一个 重要组成部分。然而，由于其吸收光能的特性，叶绿素也是个危险分子和潜在的 细胞毒素。这种情况发生在植物的光合机构被过度激活的时候，例如在强光条件 下，吸收的能量可以被转移到氧，导致活性氧(ROS)的产生。同样，叶绿素的生 物合成或降解被抑制也可导致ROS的产生和细胞死亡。在叶片衰老过程中Chi不 断被分解，原有的类胡萝卜素致使叶片呈黄色而黄化，这是一种从衰老的组织中 回收营养的主动过程1。正常生长发育的植物中，大部分Chi存在于叶片的蛋白 质复合体中，以游离态形式存在的Chi会对细胞造成光氧化损伤。为了避免游离 态

4、Chi及其有色代谢产物对细胞造成光氧化伤害，植物细胞必须快速降解这些物 质。因此，叶绿素的代谢是植物发育过程需要精确调节的过程。叶绿色的降解主 要发生在叶片衰老和果实成熟过程中，虽然叶绿素的生物化学和合成调控被广泛 深入的研究。但是它对于许多生物和非生物胁迫的响应，仍然不是很理解。叶绿本研究由国家自然科学基金(30671259)资助。* 通讯作者(Corresponding author):王玮，E-maii: 第一作者联系方式: E-maii: 素作为自然界最重要的色素之一，其生物合成途径已被研究的相当仔细，而对其 降解过程却知之甚少多年来，叶绿素的降解被认为是一个生物学之谜。1912年

5、Arthur sto 11发现叶绿素酶以来，伴随叶绿素的消失，没有发现相应的 代谢产物积累，这也许就是为什么叶绿素降解长期被忽视的原因。我们现在知道， 这些降解产物没有被发现的原因仅仅是因为它们没有颜色。在最近几年中，对这 些没有颜色的代谢产物结构的鉴定，随着降解产物结构分析和酶基因克隆 (叶绿 素酶、脱镁叶绿酸a单加氧酶和红色叶绿素代谢产物还原酶)的成功，逐渐揭示了 高等植物衰老叶片中叶绿素降解途径的奥秘。叶绿素降解产物的结构解析是了解降解代谢流向的关键。在相当长的一段时 间内，人们在衰老的叶片中找不到与叶绿素降解有关的衍生物，重要的转折点是 1991年Krautler等发现了大麦中非荧光叶

6、绿素代谢物(nonfluorescent chlorophyll catabolite from Hordeum vulgare, Hv-NCC-1,图 1)。Hv-NCC-1 的结构提示人们两 点：第一、氧化开环是发生在二氢卟吩大环的a-位，而不是先前所认为的&位； 第二、降解物由叶绿素a衍生而来，因此叶绿素b在植物体内先转化为叶绿素a 再行降解。图1 Hv-NCC-1的结构示意图Fig.1 Structure of Hv-NCC-12大多数学者认同叶绿素降解的关键是脱镁叶绿酸a单加氧酶(pheophorbide a oxygenase， PaO)催化卟啉开环，并因此将叶绿素降解途径称为Pa

7、O途径3-4。因 为PAO负责为特征的大环开环反应，出现在下游的是FCCs和N CCs5。只有识别和鉴定叶绿素代谢过程中的作为降解的自然产物的关键代谢产物， 才能更好的分析高等植物中普遍存在的叶绿素降解途径。叶绿素的降解途径可以 分为两部分：Chl的分解代谢反应分2个阶段。前一个阶段是所有植物所共有的， 即 Chl 降 解 成 无 色 的 呈 蓝 色 荧 光 的 中 间 产 物 (primary fluorescent chlorophyllcatabolite，pFCC)，这一阶段需要4种酶。首先了，Chl被叶绿素酶催 化脱去植醇基形成脱植基叶绿素a,然后由脱镁螯合酶去除镁离子形成脱镁叶绿

8、酸a6，接下来脱镁叶绿酸a经过由脱镁叶绿酸a加氧酶和红色叶绿素代谢产物还 原酶催化的两步反应转化成pFCC,中间过程形成一种不稳定的中间产物红色叶 绿素代谢产物(red chlorophyll catabolite， RCC)。最后，pFCC经过几次修饰之后 运输至液泡中。在第二个阶段，经过修饰的pFCC在液泡中发生非酶学异构形成 最终的非荧光叶绿素代谢产物NCC，这是在液泡的酸性pH条件下进行物种特异 性修饰的过程，最后转化形成单吡咯氧化降解产物。将叶绿素代谢产物从衰老的 叶绿体转运到液泡是由激活的转运途径来完成的。本文综述了叶绿素的降解PaO途径研究进展。1 叶绿素和含氯色素的反应1.1叶

9、绿素b到叶绿素a的转变叶绿素a (chlorophyll a， Chl a)和叶绿素b (chlorophyll b, Chl b)是植物体内最 为主要的两种叶绿素，Chl b向Chl a的转化可能是叶绿素降解途径的一部分。虽 然有报道表明，植物叶片衰老过程中有脱植基叶绿素b (chlorophyllide b，chlide b) 的产生，但没有叶绿素b进一步降解产物的形成8。分析大麦叶绿素无色无荧光 降解产物(non-fluorescent Chl catabolite，Hv-NCC-1)的结构表明，它与叶绿素a脱 植基后的结构相似；此外，存在于液泡中的其他叶绿素降解产物的结构均源自叶 绿素

10、a,而非叶绿素b。脱镁叶绿酸a氧化酶(pheophorbide a oxygenase, PaO)的研 究表明，脱镁叶绿酸a (pheophorbidea，pheide a)与PaO的亲和力很高，而脱镁叶 绿酸b(pheophorbide b，pheide b)对PaO活性则有抑制作用。据此可以推测，Chl b只有在转化为Chl a，后才能进入降解途径。至今，在已鉴定的叶绿素降解产物中，除了拟南芥的At-NCC-3之外，在C-7 位上均含有甲基，即叶绿素a的特征性取代基团，因此叶绿素b向叶绿素a的转 化被认为是叶绿素b降解的先决条件。这一转化过程由两种酶催化完成，它们是NADPH -依赖的叶绿

11、素b还原酶和 铁氧还蛋白依赖羟甲基-叶绿素还原酶门。叶绿素Chl (ide) b参与叶绿素分解被证 实是在衰老过程中增加其活性。最近，Chl(ide) b还原酶可以归因于水稻两个 短链脱氢酶/还原酶蛋白，称为NON-YELLOW COLORING1 (NYC1) 和 NYC1-LIKE (NOL)13-14。2007年Kusaba等在水稻的持绿突变体中，采用图位克隆技术，克隆了NYC1 基因(NON-YELLOW COLORING 1)，结果表明它是编码叶绿体定位并带有3个跨 膜结构域的短链脱氢酶 /还原酶。数据库检索表明它与水稻和拟南芥中的 NOL (NYC1-LIKE)高度相似。研究者将扩

12、增的NOL片段插入pGEX-3X质粒，构建谷胱 甘肽S-转移酶的融合蛋白，并在大肠杆菌(BL21 DE3)中表达，细胞抽提物与叶绿 素b反应后，采用高效液相色谱分析产物羟甲基-叶绿素，证实了NOL的体外叶绿 素b还原酶活性。1.2 脱植醇鉴定Pheide a作为叶绿素分解的中间代谢产物血，表明去除中央镁原子和 疏水醇侧链的开环反应优于PaO催化的含氯色素反应环的打开。多年来， chlorophyllase (CLH)催化叶绿素植醇水解反应发生在脱镁之前，即产生Chlide作 为中间代谢产物16-7,有一些报告认为存在一个相反的顺序，即脱镁发生在脱 植醇之前，产生Phei n作为中间代谢产物口8

13、，19】。并不是所有的推断的CLH基因蛋白定位于在叶绿体20。此外，最近的拟南 芥中的研究表明解决了这个问题。拟南芥中包含两个CLHs，CLH 1和CLH2,，但 缺失一方或双方各自的突变体蛋白以及RNAi沉默CLH1的植株，只在叶片衰老的 有一点边际效应。总的来说，这些数据挑战CLHS在体内叶片的衰老过程中活跃 的观点，因此，得出的结论是，在衰老叶绿素降解的过程中CLHs并不是必须需 要的21-22。By contrast, several investigations in different species support a function for CLHs. For example

14、, antisense suppression of CLH1 of broccoli (Brassica oleracea) in transgenic plants delayed the rate of postharvest Chl breakdown 74. Furthermore, Citrus CLH was convincingly shown to be active in Chl breakdown during Citrus fruit ripening, and, after heterologous overexpression in squash leaves an

15、d tobacco cells, to also promote Chl breakdown in these leaf tissues 75,76.相比之下，在不同的物种中的许多调查支持CLHs的功能。例如，对clh 1花椰菜(Brassica oleracea)反义 抑制在转基因植物中的叶绿素击穿延迟采后74 率。此外，柑橘CLH令人信服地证明是活跃在柑橘果实成 熟过程中的叶绿素的分解，和异源表达后，南瓜叶和烟草细胞，也促进这些叶组织75,76 A functional genomics screen in Arabidopsis for alternative phytolcleavin

16、g esterases uncovered pheophytinase (PPH), a 50 kDa protein located in the chloroplast stroma 14. Recombinant Arabidopsis PPH exhibited phytol-cleavage activity, which was specific for Phein. Thereby, both Phein a and Phein b were accepted as substrates, but the enzyme did not dephytylate Chl. This intriguing specificity paralleled the fact that Ar