恶性肿瘤发生发展细胞表观遗传机制

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1、项目名称：恶性肿瘤发生、发展的细胞表观遗传机制首席科学家：尚永丰 北京大学起止年限：2011.1 至 2015.8依托部门：教育部二、预期目标总体目标：本项目瞄准表观遗传学研究的前沿， 整合国内优秀研究人员， 系统深入地开 展恶性肿瘤发生发展及侵袭转移的表观遗传学研究。 本项目的总体目标如下： 阐 明表观遗传关键机制即 DNA 甲基化、组蛋白修饰和非编码 RNA 对基因表达调 控的影响； 明确表观遗传调控在乳腺癌、 肺癌发生发展及侵袭转移中的作用； 揭 示 EMT 过程中的表观遗传学变化及细胞重编程机制；阐明细胞微环境在肿瘤转 移中的作用及机制； 整合各种信息数据， 描绘乳腺癌、 肺癌发生发展

2、及侵袭转移 的分子调控网络。 通过本项目的实施， 建立和完善表观遗传学研究的新的技术体 系，实现我国在生命科学及医学研究领域的理论创新，为恶性肿瘤预警、诊断、 治疗和药物筛选提供新思路、 新途径和新靶标， 发现几个潜在的可以用于乳腺癌、 肺癌诊断的分子标志物及药物治疗的分子靶标， 并在本项目的实施过程中建立一 支具有国际竞争力的研究团队。五年预期目标：1、发现一批新的组蛋白修饰因子，探明组蛋白修饰与DNA 甲基化之间相互作用的分子机制， 筛选一批肿瘤相关 ncRNA ，鉴定一批具有潜在临床应用价值 的肿瘤诊断及治疗的新的 ncRNA 分子靶标； 鉴定一批新的 EMT 关键调控因 子；发现针对转

3、移型乳腺癌、肺癌的新的有效治疗靶点。2、建立一整套适应于恶性肿瘤表观遗传学研究的技术平台和技术体系。3、培养一批中青年学术带头人和学术骨干； 培养研究生（含硕、博）50 名以上、 博士后 12 名以上。4、在国际一流杂志（IF10）发表论文8篇以上，在有影响力的杂志（IF5）上 发表论文 25 篇以上。三、研究方案本项目分为六个课题， 将全面系统地研究乳腺癌和肺癌发生发展及侵袭转移 的表观遗传机制， 为乳腺癌和肺癌的预防、 诊断、治疗提供分子标志及药物靶标。 前三课题分别从 DNA 甲基化、组蛋白修饰、非编码 RNA 三个不同角度，分析 肿瘤发生发展及侵袭转移中表观遗传学改变， 研究其相互之间

4、的作用关系及分子 调控机理；第四课题将对肿瘤转移过程中非常重要的现象即上皮间质转换的细 胞重编程机制进行探讨； 第五课题从肿瘤微环境的角度， 探讨肿瘤微环境中基质 细胞及细胞因子对肿瘤细胞生物学行为尤其是侵袭转移的影响； 第六课题整合所 有的信息，描绘乳腺癌和肺癌发生发展及侵袭转移的分子调控网络。六个部分各有侧重，又紧密衔接，团结合作，互相促进。课题一： DNA 甲基化变化在恶性肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用本研究将筛选肿瘤细胞中高甲基化并失活的基因并分析其启动子区域组蛋 白的修饰状况，探讨 DNA 甲基化与组蛋白修饰的先后关系。筛选出影响 DNA 甲基化酶和 DNA 结合的关键性因子或蛋白；

5、 明确相关关键性因子或蛋白与 DNA 甲基化酶及 DNA 结合蛋白作用的分子机制，进一步明确特定基因发生 DNA 甲 基化的分子机制，进而揭示组蛋白修饰与 DNA 甲基化相互作用的分子机制。另 外在肿瘤组织， CBX7 等 PcG 蛋白的正常组合关系被破坏，并且这种 PcG 蛋白 组合紊乱与肿瘤相关基因失活之间可能存在因果关系。 本研究还将以多种器官的 正常组织和肿瘤组织为对象，了解正常组织细胞中 PcG 蛋白的正常组合关系， 研究这种正常组合关系破坏与肿瘤发生的关系及其与肿瘤相关基因组蛋白修饰、 核小体定位和 DNA 甲基化发生的关系。表观遗传重编程不仅在体细胞去分化和 获得多能 “干性 ”

6、方面发挥关键性作用， 也是细胞癌变过程中获得无限增殖和侵袭/转移能力的物质基础。本研究将在开展肿瘤转移相关 DNA甲基化组学研究的基 础上，筛选并鉴定出影响肿瘤细胞转移能力的关键性 DNA甲基化变化位点及其 网络，了解其在癌细胞获得转移能力重编程过程中作用，建立预测恶性肿瘤转移 能力的表观遗传分子分型体系。总体研究方案如下：DNA甲基化形成机制研究RLGS/MeDIP/Promoter array 等方分析肿瘤细胞中异常甲基化的启筛选影响DNMT和DNA结合及组蛋白修饰的关键蛋白明晰特异基因发生DNA甲基化验证研究：大样本患者随访、的分子机制和组蛋白修饰调控模式动物课题负责人：朱卫国，北京大学

7、学术骨干：邓大君，北京大学伍会健，大连理工大学生命科学与技术学院课题二：组蛋白修饰异常在恶性肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用本课题将常规方法和高通量技术相结合，从筛选乳腺癌和肺癌中新的组蛋白修饰调控因子及其复合物出发，逐步揭示所获得的候选基因对于组蛋白修饰的作 用和调控机理，并进一步阐明这些基因在调控肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用 及其机制。将以功能基因组学和蛋白质组学的方法筛选乳腺癌和肺癌中发生突变 或者表达异常的组蛋白修饰酶以及转录因子，同时针对MLL1等相关的甲基化酶复合物组分，LSD1等去甲基化酶、EYA去磷酸化酶和磷酸化激酶、转录因子 Smad4和ER及其转录辅助因子等，筛选新的组蛋白

8、修饰基因或miRNA，利用各种蛋白质间相互作用方法验证筛选获得的组蛋白修饰复合物中各成员间的相 互作用。利用基因过量表达和敲低/敲除技术、基因突变技术、组蛋白甲基化、 磷酸化和乙酰化分析、ChlP-seq等技术检测分离的组蛋白修饰因子对组蛋白修饰 和基因表达的影响及其在基因表达调控中的分子机制。在此基础上，利用动物模型和临床标本对组蛋白修饰候选因子在肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用做深 入分析。总体研究方案如下：组蛋白修饰异常机制与肿瘤发生发展和ER转录因子等高通量芯片、酵母双杂交、免疫沉淀一-质谱 量 双杂交机制J筛选新的组蛋堂饰复合物/因相互作用组蛋白修饰靶基因表达建立肿瘤发生发展侵袭转移相

9、关的组蛋白课题负责人：叶棋浓，军事医学科学院生物工程研究所学术骨干：杨晓，军事医学科学院生物工程研究所课题三：非编码RNA在恶性肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用研究ncRNA作用机制的一个关键就是鉴定与之相互作用的靶分子，特别是 蛋白分子。本课题将以乳腺癌细胞系、肿瘤组织、肿瘤启动细胞为模型，利用自 主建立的RNA-SELEX-seq技术平台系统地发现和鉴定与肿瘤相关蛋白(特别是 其中的转录因子和表观修饰酶)发生相互作用的n cRNA;还将采用不同大小的ncRNA的cDNA文库(size-fractioned RNA library)鉴定肿瘤启动细胞特异的 ncRNA。采用球囊形成实验、二维平皿

10、及三维Matrigel培养以及免疫缺陷鼠体内 种植和肿瘤组织等研究体系，系统深入地研究ncRNA和蛋白间的相互作用、它们所构成的结构网络、调控网络、以及这些相互作用的生理功能，剖析n cRNA调控网络在肿瘤发生发展进程中的作用与意义。与此同时，选择其中一些有重要功能的ncRNA，结合大量的肿瘤患者的标本及临床资料，研究将其作为药靶或 生物标记物的可能性。非编码RNA与肿瘤发生发展研究阐明ncRNA-蛋白调控网络与肿瘤发生发展课题负责人：宋旭，四川大学 学术骨干：宋尔卫，中山大学李沁桐，四川大学课题四：上皮-间质转换的机理及恶性肿瘤侵袭转移的细胞重编程机制以乳腺癌细胞系、肿瘤组织及癌旁正常组织为

11、模型，探讨EMT的细胞重编程作用机理及其在乳腺癌转移及化疗药物耐受中的作用。选取永生化的正常乳腺 细胞系（如MCF-10A），ER阳性低转移性细胞系（如 MCF-7, T47-D等），ER 阴性高转移细胞系（如MDA-MB-231，SUM1315等），以及ER阳性但对三苯氧 胺耐药的BT-474细胞等为主要细胞模型，并通过lentivirus介导的shRNA抑制 或过表达E-cadherin在这些细胞系中分别诱导或抑制 EMT表型。比较不同细胞 系在EMT前后其基因表达谱变化，用 MeDIP-seq法比较基因组范围内DNA甲 基化变化情况，并用 ChIP-seq法比较与转录相关的主要的组蛋白修

12、饰标志如激 活性的组蛋白乙酰化、H3K4甲基化，抑制性的H3K9，H3K27，H4K20甲基化 等在全基因组范围内的分布变化规律。在此基础上，对差异表达的新基因及特异性组蛋白修饰酶在EMT以及在乳腺癌转移及药物耐受中的作用做深入分析。同 时，选取两种以上高转移性细胞系，以TGF：或TNF刺激细胞或稳定转染-catenin分别激活TGF NF B以及Wnt信号通路诱导EMT。用基因表达谱、 蛋白质谱及全蛋白磷酸化谱分析在三种条件下共同变化的靶基因及蛋白分子。这些共同通路分子是各信号通路间的交互作用节点及潜在的EMT关键调控因子，对它们的作用机理进行进一步细胞及分子水平上的分析。建立可诱导表达荧光

13、标 记的E-cadherin或其它EMT诱导因子的稳定转染细胞系，以在细胞及分子水平上实时观察细胞内外环境的改变对 EMT及细胞转移能力的影响。总体研究方案 如下:上皮间质转换的机理及表观遗传机制n建立低转移性、高转移性乳腺癌细胞系及人工改变E-cadherin水平诱导或抑制EMT后的以TGF B或TNF。刺激细胞或稳定转染P-catenin分别诱导癌细胞发生EMT蛋白质匚並毕曰谱差异磷酸化修饰蛋白质组学差异基因表达谱差异MeDIP-seq 检测DNA甲基化变化ChIP-seq检测主要转录相关组蛋白修饰差异表达基因总体特征分析病毒介导的功能域分析;质谱检测并验证相互作用蛋白；靶基 因检测：与已

14、新基因功能分析及特异性组蛋白修饰酶在EMT中的作用稳定过表达及shRNA抑制候选基因后，细胞表型及小鼠乳腺寻找高转移性乳腺癌及对现有化疗药物不敏课题负责人：尚永丰，北京大学医学部学术骨干：梁静，北京大学医学部张华，中国航天员科研训练中心课题五：细胞微环境与肿瘤的发生发展及侵袭转移以乳腺癌为模型，分别从肿瘤细胞微环境中的肿瘤相关成纤维细胞、 浸润的 免疫细胞（肿瘤相关性巨噬细胞）和基质分子（细胞因子 TGFB ）入手，研究肿 瘤微环境对肿瘤细胞生物学行为尤其是侵袭转移的影响。 分离乳腺良性增生患者及各种不同类型不同分期的乳腺癌患者组织微环境中的成纤维细胞及肿瘤相关 性巨噬细胞，分析 miRNA及

15、mRNA的表达谱；研究这些差异表达的基因或 miRNA对成纤维细胞及肿瘤细胞侵袭转移能力的影响；建立三维细胞培养模型，将肿瘤细胞与基质细胞共培养，尽量模拟体内环境，并应用免疫分子及免疫细胞 缺陷小鼠构建小鼠骨髓嵌合体动物模型，研究这些差异表达的基因或miRNA对共培养后肿瘤细胞侵袭转移能力的影响； 采用基因工程小鼠模型，从分子、细胞、 动物三个层面研究TGFB信号通路在肿瘤微环境中与 REG蛋白酶体激活因子、 p53等重要肿瘤因子动态相互作用及其动态调控的分子机制。在解析这些调控机制的生理病理意义的基础上，通过肿瘤模型研究进一步阐明肿瘤微环境中重要生 物学因子对肿瘤发生发展的决定性作用。具体方案如下：细胞微环境与肿瘤发生二发展及侵袭转移-基质细胞、细胞因子在肿瘤发生发展中的作用正常乳腺组织及不同类型的乳腺癌组织itP肿瘤相关成纤维细胞原代培养肿瘤相关性巨噬细胞TGFB信号通路/REGY蛋白酶体Sw-1分子、细胞水平动物水平n建立基质细胞与mRN