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1、培养基有很多种，你要配制哪一种呢？你要查清楚，你要配的培养基的成分有那些，然后把要用的东西找到。在配制之前你要把装培养基的 容器准备好，是用试管、平皿还是三角瓶。之后看要配的是固体培养基还是液体培养基觉得是否放 琼脂或明胶。之后找来一个大烧杯，依次把要放的物质放入要是配的是固体培养基要把加入琼脂或 明胶的培养基放在电炉上加热，待琼脂或明胶完全溶解后趁热迅速分装之后把分装好的培养基封口， 之后选择是干灭还是湿灭，等灭菌之后，配制培养基的工作就完成了。培养基的配制与灭菌1目的1.1 了解并掌握培养基的配制、分装方法1.2掌握各种实验室灭菌方法及技术。2原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料
2、。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要 求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从 营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外， 培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98100C 下融化，于45C以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。3材料3.1器皿及材料天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、
3、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管 及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛 皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。3.2药品试剂蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽计、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。4流程称药品溶解一调pH值一融化琼脂一过滤分装包扎标记一灭菌一摆斜面或倒平板。5步骤5.1培养基的制备5.1.1称量药品根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋白胨极易吸
4、潮， 故称量时要迅速。5.1.2溶解用量筒取一定量（约占总量的1/2）蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅 拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉 用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。5.1.3 调节 pH根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度 计等。5.1.4溶化琼脂固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融 化后才能停止搅拌，并补足水分水需预热）。注意控制火力不要使培养
5、基溢出或烧焦。5.1.5过滤分装先将过滤装置安装好（图3-1）。如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸，如果是固体或半固体 培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤。过滤后立即进行 分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。液体分装高度以试 管高度的1/4左右为宜。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜； 分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。5.1.6包扎标记培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称，制 备组别和姓名、日期等。5.1.7灭菌上述培养基
6、应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为21C20min，以保证灭菌效 果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜 面（图3-2），斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体 深层琼脂。5.1.8倒平板将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却至到4550C,立刻倒平板。5.2灭菌方法灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要 介绍物理方法的一种，即加热灭菌。加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质 的凝固变性与其自
7、身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低在同一温度下，湿热的杀 菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可 增加灭菌效力。5.2.1.高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点 随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到 121C，经1530min,可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的饱子或芽饱。一般培养基、玻 璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌（图3-4）。5.2.1.1操作方法和注意事项如下加水打开灭菌锅盖，向
8、锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。 注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。装料、加盖灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。 排气打开排气口（也叫放气阀）。用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸 汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。升压、保压和降压当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维持 恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121C，20min）后， 停止加热，待压力降至接近“时，打开放气阀。注意不
9、能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下 降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。灭菌后的培养基空白培养灭菌后的培养基放于37C培养箱中培养，经24h培养无菌生长，可保存备用；斜面培养基取出后， 立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后，空白培养。5.2.2干热灭菌法通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中 烘烤，即加热至160170C维持12h。干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用 此法灭菌。5.2.2.1灭菌前的准备玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞，以保证玻
10、璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染。常用玻 璃器皿的包扎和加塞方法如下:平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内;三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚 纸，用棉绳以活结扎紧，以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中 心，轻轻捅入管口，松紧必须适中，管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去，灭菌时将吸管装入金属 管筒内进行灭菌，也可用纸条斜着从吸管尖端包起，逐步向上卷，头端的纸卷捏扁并拧几下，再将包 好的吸管集中灭菌。5.2.2.2干燥箱灭菌将包扎好的物品放入干燥烘箱内，注意不要摆放太密，以免妨碍空气流通；不得使器皿与烘箱的内层 底板直接接触。将烘箱的温度升至160170C并恒温12h，注意勿使温
11、度过高，超过170C，器 皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧。如果是为了烤干玻璃器皿，温度为20C持续30分钟即可。 温度降至6070C时方可打开箱门，取出物品，否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂。用此法灭菌时，绝不能用油、蜡纸包扎物品。5.2.2.3火焰灭菌直接用火焰灼烧灭菌，迅速彻底。对于接种环，接种针或其它金属用具，可直接在酒精灯火焰上烧至 红热进行灭菌。此外，在接种过程中，试管或三角瓶口，也采用通过火焰而达到灭菌的目的。6结果6.1记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件（温度、压力等）。6.2试述高压蒸汽灭菌的过程及注意事项。7思考7.1制备培养基的一般程序是什么？7.2做过本次实验后，你认为在制备培养基时要注意些什么问题？7.3灭菌在微生物学实验操作中有何重要意义？4试述高压蒸汽灭菌的操作方法和原理。5高压蒸汽灭菌时应注意哪些事项？
