《HPLC的使用步骤》由会员分享，可在线阅读，更多相关《HPLC的使用步骤（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、高效液相色谱法测定止痛药由David L. Zellmer和罗伯特-威廉姆斯（基于由得克萨斯州A&M大学的玛丽安海曼的实验）1997年4月版本1.02 （轻微的补充和修正），2000年5月该方法我们将使用高效液相色谱法（HPLC）分离市售的止痛药乙酰水杨酸，咖啡因和对乙 酰氨基酚。你必须选择一个产品，至少有两个在它上面的成分。该软件包应该给 你制造商组成。在分析的结论，你可以比较你的结果，与包装上指明的。不要以 为包是正确的的。书面报告的目的是，建立你的分析信誉。下面给出我们分离的化合物的结构。一个化合物已增加，水杨酸。这种物质将我 们的内部标准，将在不断的金额加入到我们所有的标准和未知的运行
2、。CaffeineAcetylsalicylic Acid0dOHSalicylic AcidAcetammoplieii我们的色谱柱将是一个30厘米C - 18柱，在性格上比较非极性。我们的流动相， 将水，甲醇和醋酸的混合物。通过不同的水-甲醇混合，我们可以控制我们的溶 剂的极性。通过改变醋酸，我们可以改变它的pH值。在酸性条件下，我们可以 期望，对乙酰氨基酚或咖啡因氮原子（两个看起来像他们可能会弱碱）拿起一个质 子和成为一个高度极性的离子，而乙酰水杨酸和水杨酸（包括弱酸）继续作为弱极 性分子。另一种可能性是对乙酰氨基酚不拿起任何质子，但在自己的权利非常极 性。这可能是一个足够强大的弱酸阴离
3、子存在羟基，如果失去一个质子，在流动 相的pH。由于“像吸引了像”我们所期望的乙酰水杨酸和水杨酸列交互举行，而 对乙酰氨基酚或咖啡因通过更迅速。现实生活中是从未相当简单，所以我们必须 发挥我们的溶剂组成，运行的色谱，我们得到什么。我们希望看到的是类似下面 的模拟色谱。3分钟，高峰期可能是对乙酰氨基酚或咖啡因，8分钟可两个氨基酸之一，但不要 指望它。你必须制定一种方法，一旦你已经达到基线分离，以确定您的峰。这是 地方标准进来，我们将准备标准溶液，对乙酰氨基酚，乙酰水杨酸，咖啡因和水杨 酸。这些都将结合创建一系列的校准解决方案，将使我们能够确定峰，峰面积和 浓度的标准之间的关系是什么。仪器标准的实
4、验室报告的部分原因是你已经使用的实际设备的识别和描述，所以一定要 确保你“在实验室中的东西”的所有设备制造商和型号，以及源（国家的制造商， 而不是）和特点（HPLC级，试剂级，一级标准等级等），化学品和其他材料。从 这里描述你的实验装置，可能会有所不同，所以不只是为您的报告中复制。（不 要复制的另一个很好的理由是为了避免与抄袭指控！）HeliumHPLC系统的所有组件都在这里显示，只是你必须控制。在溶剂，可通过该系统的泵，它必须用氦气“sparged”去除水中溶解的空气。泵 内或列的溶剂出口压力突然变化可能会导致泡沫的出现。这些气泡泵内可以实际 损害的机制，并至少会导致泵停止移动的液体。分光探
5、测器的细胞内，气泡会导 致通过它的光强度的波动，给人非常嘈杂的输出信号。使用非常低的氦流量喷雾 为5分钟左右的样品，然后关闭启动泵之前，氦关闭。（如果溶剂中含有有毒的 化学品，引擎盖下喷射。）溶剂瓶中小矩形是特殊的不锈钢“ airs tones ”作为为溶剂，要么过滤器或氦气鼓泡。素泵，我们重视一个50 ml注射器（柱塞的方式）总理/冲洗阀的出口。打开阀门 几圈，然后打开泵和按RUN按钮。如果您没有看到总理/清除漏的液体，按素瞬间 泵上获得更快的抽水率。返回建立流体流动时运行。您可能需要拉注射器，以帮 助通过泵在第一溶剂。当你看到没有更多的气泡进入注射器，泵催芽。关闭的主 要阀门。泵现在应该迫
6、使溶剂通过系统的其余部分。 观察它退出探测器。 确保 浪费烧杯中收到。卸下总理的注射器和空到废液容器。设置泵每分钟1.0毫升。如果一切顺利，泵的压力稳定在2000 PSI。 如果有人 注射到列未过滤CRUD的压力将上升到最高的临界值，然后在你的蜂鸣声，如果报 警都被设置。关闭泵。如果你是幸运的，所有需要接下来发生的是为你做的水管 位和更换过滤器或预柱。如果你很不幸，你就可以开始300美元购买一个新的列。 打开可变波长检测器，将其设置为250纳米。因为探测器的输出被发送到电子积 分，而不是其内置图表记录，剩余的探测器控制大部分将输出没有影响。打开积分。几家公司进行集成，内部是相同的，只有外面的熊
7、光谱物理或瓦里安 标志。下列指示对任何这些相同的工作。当你第一次打开它，它会询问日期和时 间你。无论是输入信息，或者只是打ENTER离开这些空白。BR设置峰值阈值（PT） 1000输入偏移的偏移PT SHIFT = 1 0 0 0 ENTER。 （请 注意，你能告诉多少次你推编辑光转变 -只是尝试。）衰减（AT）的设置与安泰信5到512 1 2输入。设置图表的速度（CS）每分钟0.5英寸（厘米每秒）与中华电信SPD。 5 输入。 泵出足够的溶剂清理掉所有的气泡，从以前的运行（当然遗留下来的其他杂 质，你会不会离开列CRUD使用完毕后，你会提示：泵纯甲醇，然后再关闭 仪器下来这一天。）零的集成与
8、注入探测器上的积分为零，按A，按自动归零。按再次注入时 的基准似乎已经稳定下来。如果有很多的漂移或噪声，您可能需要重复此 步骤，直到事情稳定。 你的导师和朋友会告诉你其他的集成控制。当你学习的特点，把它们写下 来。该手册几乎是完全无用的教学初学者。即使是经验丰富的色谱，完全 忘记了如何使用其中之一，如果他们采取一个长假。为了使运行，首先要确保您正在运行的样品已经被过滤。下面的过程，包括使用 的Whatman#42滤纸过滤步骤。其他程序可能要求强制通过注射前的微孔过滤器 样品。但是你这样做，确保没有漂浮在你的样品CRUD当你注入到列。除非另有 指示，强行通过微孔过滤器之前，所有样品装入注射器。一
9、个特殊的注射器用钝尖的针是用来注射循环加载到样品。 过滤样品填充注射器 转动喷油器的闭环控制加载 针推进样口一路，直到对特殊装修密封。牢牢按住，以尽量减少泄漏。 注入样品，直到你看到它的到来的浪费样品循环结束。打开注入样品回路，然后立即按Integrator来启动它的数据运行注入一个。 毕竟峰积分器的输出显示，按注入再次停止运行。如果报告不自动打印出 来，按报告得到所有峰的上市，伴随着他们的领域和保留时间。流动相溶剂我们会为您准备的溶剂。您必须使用新鲜的溶剂和流动相。如果您发现从上学期 遗留下来的旧溶剂，有新的组成。检查预想任何污染的纯溶剂的容器。 （我们 发现在我们的甲醇一学期，堵塞一切底部
10、一层的CRUD）使用40%（V/V）甲醇和 60%（V / V）水，1.5%（V / V）冰醋酸已添加。10微米，30厘米C - 18柱 得到很好的分离。所有材料应为色谱纯。 你可以试试便宜的东西，但不怪我们， 如果你因为在溶剂中的杂质基线漂移。本实验的原始版本采用了梯度泵和溶剂编 程来改变在运行过程中的组成。我们正在运行一个不变的流动相“等度”。准备样品和标准下面的建议浓度可能不会给峰的最佳设置。如果你发现你的一些山峰是如此之大， 该仪器是不等，而其他峰太小，无法可靠地计量，准备建议的浓度变化。 看在你 选择的片剂的成分的浓度。你的程序必须结束，支架在片剂中发现的数额标准。千 万不能只是一味
11、地依照下面的指示。选择金额会为您的分析工作。另一个要考虑的是你的废物流。尽量减少试剂，如甲醇，使用后需要扣押的金额 这个实验的原始版本，称为100 mL甲醇溶解样品。我们已经减少这在大多数情况 下，30毫升。内部标准（甲醇水杨酸）：HPLC级甲醇冲洗100 mL容量瓶中。称取1500毫克的 水杨酸，用甲醇定量转移到烧瓶中，溶解，并弥补该商标。未知样品（药片溶解在加甲醇内部标准）：我们的止痛片组成的有效成分加粘结剂， 将不溶于必须过滤掉。检查标签的成分金额。 您可能不希望解散整个数位板;成 分的数额必须符合你想准备在标准之内。称量称量瓶（WB），加一粒，再次称重。用迫击炮和杵粉碎的片剂。你可 以
12、尽可能转移到WB。它再次称重。冲洗一个125毫升锥形瓶中，用甲醇。你觉得是适当的入烧瓶从WB的，转 让片剂。再次称量白平衡。现在，使用量筒，添加30 mL甲醇的容量瓶中。 摇动烧瓶解散所有水溶性成分的片剂。 使用类吸管这个烧瓶中加入10.0毫升的内部标准。 涡流混合均匀。 用封 口膜密封烧瓶，防止蒸发。在这一点上，你有已知的平板质量和已知质量的水杨酸在这个烧瓶标准。 无论 我们现在做的这个解决方案将不会改变片剂成分质量比水杨酸质量。形成约9厘 米的Whatman#42滤纸成锥形过滤到10 mL烧杯中几毫升的解决方案。然后倒入 注射器这一解决方案，并迫使它通过微孔过滤器。 注入的高效液相色谱法为
13、一个 未知的运行这种过滤解决方案。校准标准（数量不等阿司匹林和咖啡因加上内部甲醇标准）如果您的未知中有对乙 酰氨基酚，确保您不超载你的列。例如，虽然Exedrin可能含有对乙酰氨基酚250 毫克，我们将获得由列在这个级别的超载造成分裂的高峰。使用对乙酰氨基酚25 毫克。 阿司匹林和咖啡因的建议值可能会工作的规定。使用四个125毫升锥形瓶，用甲醇冲洗。在30毫升的甲醇固体溶解后再加入内部 标准。 阿司匹林和咖啡因的金额只作例子。 你应该选择适合你分析片剂的金额。 例如，一瓶“额外的力量” Exedrin的规定，每片对乙酰氨基酚250毫克，250毫 克的阿司匹林， 65毫克的咖啡因。 假设我们选择
14、了解散半粒。 然后将我们的标 准合理的选择：保温 瓶#阿司匹 林咖啡因甲醇内标1100毫克40毫克30毫升10.0 毫升2125毫 克30毫克30毫升10.0 毫升3150毫 克20毫克30毫升10.0 毫升4175毫 克10 毫克30毫升10.0 毫升未知1 / 2 片1 / 2 片30毫升10.0 毫升为了避免称量固体的各个部分，小到1 0毫克，准备在甲醇阿司匹林和咖啡因的标 准解决方案，添加适当的卷，足够的甲醇将达到约30毫升。 （您可以使用一个 较大的体积比为30 mL,如果你需要，只要保持最终大致相同的音量，让所有的解 决方案，我们将得到类似的探测器响应。）如果你有问题让咖啡因溶解，
15、尝试使用 一些acidfied水/甲醇作为溶剂的流动相。水和较低的pH值应变成阳离子的咖啡 因，会很容易溶解。 然后添加10.0毫升的内部标准。 阿司匹林和咖啡因的解决 方案的组成是留给学生的练习。记住太探测器在250 nm处的吸光度措施。这些物质都不会在此波长相同的摩尔吸， 类似金额的不同高峰大小。您可能需要调整的浓度，如果您的探测器不能准确地 测量出全方位为您所选择的的浓度峰值大小。（见关于上面给出的对乙酰氨基酚 警告。）一个一般的规则是，显示共轭双键的广泛网络的结构比那些不应该有较高的摩尔吸光系数。分析数据运行后的未知和校准标准，并得到所有峰的保留时间和峰面积，准备绘制校准运行 的峰面积/内标峰面积与毫克的标准工作曲线，然后用峰面积/内标峰读取校准曲线 的金额从你未知运行的高峰区。 使用通常的统计方法对您的工作曲线。 你应该可 以推断峰峰面积的变化，当您运行的标准。 进行适当的计算，在原粒计算各成分 的毫克。
