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1、n 当前文档修改密码：8362839实验一 植植物原生生质体的的分离和和培养一教学目目标：了了解植物物原生质质体作为为细胞工工程研究究的重要要意义，了了解原生生质体活活性鉴定定的原理理。掌握握分离和和培养原原生质体体的技术术、方法法和原理理。掌握握细胞活活性的检检测方法法。掌握握细胞计计数的原原理和方方法。二重点：掌握分分离和培培养原生生质体的的技术、方方法和原原理。掌掌握细胞胞活性的的检测方方法。掌掌握细胞胞计数的的原理和和方法。三难点：分离和和培养原原生质体体的技术术。四授课方方式与教教学方法法：讲解解原理、实实验操作作示范或或具体指指导。五教学内内容:实验原理植物原生质质体(pprott
2、opllastt)是除除去细胞胞壁后 为原生生质所包包围的“裸露细细胞”,是开展展基础研研 究的理理想材料料。其中中,酶解法法分离原原生质体体是一个个常用的的技术,其原理理是植物物细胞壁壁主要由由纤维 素、半半纤维素素和果胶胶质组成成,因而使使用纤维维素 酶、半半纤维素素酶和果果胶酶能能降解细细胞壁成成分,除 去细胞胞壁,即可得得到原生生质体。由由于原生生质体内内 部与外外界环境境之间仅仅隔一层层薄薄的的细胞膜膜,必须保保持在渗渗透压平平衡的溶溶液中才才能保持持其完整整性, 使原原生质体体分离后后不致膨膨胀破裂裂，渗透透剂常用用甘露醇醇或蔗糖糖，酶液液还应含含一定CCa2+来稳定定原生质质膜。
3、 其次,还应当当考虑取取材、酶酶的种类类和纯度度、酶液液 的渗透透压、酶酶解时间间及温度度等因素素对分离离原生质质 体的影影响。将将原生质质体接种种在培养养基上进进行培养养，细胞胞壁再生生，细胞胞分裂和和再生植植株。测定原生质质体的活活性有多多种方法法。荧光光素双醋醋酸酯(FDAA)染色色是常用用的一种种方法,FADD 本身身无荧光光,无极性性,可透过过完整的的原生质质膜。 一旦进进入原生生质体后后,由于受受到酯酶酶分解而而产生 具有荧荧光的极极性物质质荧光素素。它不不能自由由出入原原 生质膜膜,因此有有活力的的细胞能能产生荧光,无活力力 的原生生质体不不能分解解FADD无荧光光产生。 细胞计
4、数一一般用血血细胞计计数极，按白细胞计数法进行计数。从理论上讲讲，植物物体的任任何一部部分都可可以通过过酶解作作用去除除细胞壁壁而得到到原生质质体。但但在实际际操作中中，只有有幼嫩的的组织才才能完成成去壁的的过程。所所以，为为了制备备健康的的原生质质体，一一般选用用根尖、茎茎尖、嫩嫩叶及对对数生长长期的愈愈伤组织织为材料料，一旦旦细胞具具有木质质化或次次生加厚厚的外壁壁，则不不能被酶酶降解。因因此，取取材成为为实验成成功与否否的首要要问题。 花期短的花瓣，由于其组织鲜嫩，又具有色素标记，是该实验中较好的材料。实验方法1把叶片片(或花期期短的花花瓣)洗净，把把表面水水吸干。（2人一组）2撕去叶叶
5、片背面面的表皮皮，用22ml离心心管的盖盖打下11圆片。圆圆片扣压压于 00.5mml酶液液面上。让去除下表皮的一面接触酶液，辅满一层。0.5ml酶液已放入2ml离心管中。（酶液：4%纤维素酶， 2%果胶覆酶，PH5.8，0.6mol/L甘露醇）。32830保温酶酶解26h（放放培养箱箱中）；镜检叶叶肉细胞胞原生质质体。用用血球计计数板计计数。46000 rppm 离离心5mmin，使使原生质质体沉降降。吸除除上面的的酶液。5加0.2 mmol/L 的的加氯化化钙液00.5mml，轻轻轻吹打打均匀。6用1mmL注射器器向离心心管底部部缓缓注注入200%的蔗糖糖溶液11ml，出出现下部部蔗糖液液
6、，上部部原生质质体悬浮浮液.以6000rpmm离心100 miin，在在两液相相之间出出现一条条绿色带带，便是是纯净的的原生质质体。7用1mmL注射射器取出出管底的的杂质、下下部蔗糖糖溶液和和上部氯氯化钙液液。少许许原生质质体于载载片上，盖盖片观察察其形态态，检测测纯度。8加MSS培养液液液1mml洗涤涤，轻轻轻混匀，600 rpm 离心5min，使原生质体沉降。吸除上面的溶液。9加MSS培养液液液0.5mll, 轻轻轻混匀匀, 用血血球计数数板计数数细胞密密度, FDAA染色测测定原生生质体的的活性。10扣上上盖子，在26下进行暗培养。观察细胞壁的再生和细胞分裂。实验结果结果讨论六课堂小小结
7、：根据学生的的实验结结果进行行总结。 细胞计数板板的使用用：细胞计数板板系一长长方形厚厚玻片，常常用的改改良牛氏氏(Immproovedd-Neeubaauerr) 计计数板在在中央横横沟的两两边各有有一计数数室，两两计数室室结构完完全相同同。计数数室较两两边的盖盖玻片支支柱低00.1毫毫米。因因此，放放上盖玻玻片时，计计数板与与其间距距即计数数室空间间的高为为0.11毫米(图8-11)。在在低倍显显微镜下下可见计计数室被被双线划划分成个边长长为毫毫米的大大方格。四四角的大大方格又又各分为为个个中方格格，这是是用来计计数白细细胞的。中中央大方方格被划划分为个中中方格，每每一中方方格又划划分成个
8、小小方格(图82称=4400小小方格，也也有的计计数板为为=4400格格的，小小方格面面积一致致)。中央央大方格格的四角角及中心心个中中方格(者者则为四四角上的的中方格格)为红细细胞或血血小板计计数范围围。细胞计数先用试管稀稀释法制制备禽类类血细胞胞悬液：将禽类类红细胞胞稀释液液、分别置置水浴锅锅中预热热到，取液mLL于试管管中，用用吸血管管加入新新鲜鸡血血(或肝素素抗凝血血)霯霯，再加加入液mLL混匀，置置该水浴浴锅中保保温s左右，置置室温，即即为待检检的血细细胞悬液液。可用用于充液液计数。取取干洁的的计数板板，置于于水平的的显微镜镜载物台台上，盖盖上盖玻玻片，使使两侧各各空出少少许。摇摇匀
9、血细细胞悬液液，用滴滴管吸取取，将滴滴管尖轻轻轻置于于盖玻片片边缘外外，让滴滴出的血血细胞悬悬液凭毛毛细管作作用吸入入计数室室内，刚刚好充满满计数室室为宜(图83)。静静置mmin后后计数，先先用低倍倍镜观察察，不均均匀则抛抛弃。计计数时用用虹彩、集集光器、反反光镜等等调节入入射光角角度和强强度，认认清 计数室室位置。采采用“由上至至下，由由左至右右，顺序序如弓”的顺序序，对压压边线细细胞采取取“数上不不数下，数数左不数数右”的原则则(图84)。依依次计数数并记录录个中中方格中中分别有有多少个个红细胞胞。注意事项1计数板板、盖玻玻片和测测定管用用清水冲冲洗，再再用绸布布或细布布沾干。2.充液液
10、前应充充分混匀匀血细胞胞悬液，充充液要连连续、适适量，充充液后应应待血细细胞下沉沉后再计计数。3.计数板板、盖玻玻片、吸吸血管及及测定管管等用过过后必须须立即按按要求洗洗涤干净净。实验二、细细胞膜的的通透性性观察实 验 目目 的 了解细胞膜膜的渗透透性及各各类物质质进入细细胞的速速度。 实 验 原原 理 将红细胞放放入数种种等渗溶溶液中，由由于红细细胞对各各种溶质质的透性性不同，有有的溶质质可以渗渗入，有有的不能能渗入，渗渗入的溶溶质能够够提高红红细胞的的渗透压压，所以以促使水水分进入入细胞，引引起溶血血，由于于溶质透透入速度度互不相相同，因因此溶血血时间也也不相同同。 实 验 用用 品 一、
11、器材 50ml烧烧杯, 试管（1110ccm）, 110mll移液管管, 试管管架。 二、材料 羊血。 三、试剂 0.117mool/LL氯化钠钠，0.17mmol/L氯化化胺，00.177moll/L醋醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 实 验 方方 法 一、羊血细细胞悬液液取50mll小烧杯杯一个，加加1份羊血血和100份0.177moll/L氯化钠钠，形成成一种不不透明的红色液液体，此此即稀释释的羊血血。二、低渗溶溶液取试管一支支，加入入10mml蒸馏
12、馏水，再再加入11ml稀稀释羊血血，注意意观察溶溶液颜色色的变化化，有不不透明的的红色逐逐渐澄清清，说明明红细胞胞发生破破裂造成成1000%红细细胞溶血血，使光光线比较较容易透透过溶液液。三、羊红细细胞的渗渗透性1、取试管管一支，加加入0.17mmol/L氯化化钠100ml，再再加入11ml稀稀释羊血血，轻轻轻摇动，注注意观察察溶液颜颜色有无无变化？有无溶溶血现象象？为什什么？2、取试管管一支，加加入0.17mmol/L氯化化胺100ml，再再加入11ml稀稀释羊血血，轻轻轻摇动，注注意观察察溶液颜颜色有无无变化？有无溶溶血现象象？为什什么？3、分别在在另外8种等渗渗溶液中中进行同同样实验验。
13、步骤骤同2。实 验 结结 果并对实验结结果进行行比较和和分析。实验三 细胞骨骨架的观观察一、实验目目的掌握用光学学显微镜镜观察植植物细胞胞骨架的的原理 及方法法，观察察光学显显微镜下下细胞骨骨架的网网状 结构。 二、实验原原理植物细胞用用适当浓浓度的TTrittonXX1000处理 后，可可破坏细细胞内蛋蛋白质，但但细胞骨骨架系统统的蛋 白质却却保护完完好。考考马斯亮亮蓝R2250(Cooomasssiee brrillliannt bbluee R2250)是一种种蛋白质质染料，处处理后 的材料料用考马马斯亮蓝蓝R2500(考马马斯亮蓝R2550) 染色后后，用光光学显微微镜观察察，可以以见
14、到一一种网状状 结构，即即是细胞胞骨架结结构。三、材料洋葱鳞叶四、试剂1)2考考马斯亮亮蓝R2250染染色液：称考马马 斯亮蓝蓝R25501gg，溶于于2500ml无无水乙醇醇中，加加 冰醋酸酸35mml.再再加蒸馏馏至5000mll. (2)磷酸酸缓冲液液(pHH 68)：60mmmolL 磷酸酸缓冲液液，调至至pH66.8 (3)M缓缓冲液(pH 72)550mmmolL咪唑， 50mmmoll/L)氯化钾钾、05mmmolL氯化镁镁、11mmool/LL 乙二二醇(aa-氨基基乙基)醚四乙乙酸、00.1mmmoll/L乙乙二胺四乙乙酸； 1mmmolL巯基乙醇醇，调至至pH 72。 (4
15、)1%Triion X-1100：用M缓冲液液配制。 (5)3%戊二醛醛：用磷磷酸缓冲冲液配制制； (6)中性性树胶。 仪器(请参参看仪器器图库)：显微微镜，烧烧杯，镊镊子。玻玻璃滴管管，载玻玻片 五、实验步步骤1.用镊子子撕取洋洋葱鳞叶叶内侧的的表皮若若干片 约1cmm2大小若若干片)，置于于50mmL烧杯杯中，加加 入pH6.8磷酸酸缓冲液液，使其其下沉； 2.吸去磷磷酸缓冲冲液，用用1Triitonn X1000 处理理20mmin。3.吸去TTritton X1000，用M缓冲液液洗3 次,每次5mmin。 4.用3戊二醛醛固定330miin。 5.磷酸缓缓冲液(pH 68)洗3次，每每次5mmin。6.0.22%考马马斯亮蓝蓝R2550染色色10mmin。 7.蒸馏水水洗2次，然然后将样样品置于于载玻片片上,加盖玻玻片，于于普通光光学显微微镜下观观察。 8.如果染染色效果果好，则则可依次次用500乙 醇、
