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1、细胞工程复习重点第一代生物工程:以酿酒为代表近代生物工程：以抗生素的大规模生产为标记现代生物工程：以DNA重组技术为代表组成：发酵工程、酶工程、细胞工程、基因工程、生物化学工程、蛋白质工程等基因工程是核心和关键细胞工程是基础酶工程是条件发酵工程和生物化学工程是手段细胞工程：应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。探究期：19世纪末至20世纪初动物：哈里森开创先河，青蛙神经细胞在淋巴液培育几周，长出神经纤维植物：温特，高特里特，诺比考特奠基人（高特里特，诺比考特同时离体培育胡萝卜）特点：对植物、动物组织细胞
2、培育进行初步尝试，技术不完善，方法不成熟，胜利率低。动物细胞工程包括：细胞培育技术；干细胞技术；细胞融合技术；染色体工程；胚胎工程技术（试管婴儿-体外受精、胚胎移植、胚胎分割等）；克隆技术。细胞融合的概念：采纳自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞。意义：产生新的物种或品系。干细胞( stem cells )工程和再生医学干细胞特性：具有肯定或无限的增殖实力；具有向各个组织细胞分化的实力。存在部位：几乎任何一个组织器官中均存在干细胞。染色体工程：就是按人们的须要来添加、消减或替换生物的染色体的一种技术。胚胎工程对哺乳动物的早期胚胎进行某种人为的工程技术操作获得人们所须要的成个体。体
3、外受精技术（试管婴儿）、胚胎移植（代孕母亲）、性别鉴定技术（疾病诊断）、胚胎冷冻技术。细胞工程应用：优质植物的快速培育与繁殖优质动物资源的培育与繁殖，濒危动物的爱护；生产活性产物与药物；新型动植物品种的培育；再生医学；转基因动植物生物反应器。动物细胞培育特征哺乳动物细胞植物细胞微生物细胞大小/um10-10010-1001-10生长形式悬浮，贴壁悬浮悬浮养分要求很困难较困难简洁倍增时间/h12-6020-1200.5-2细胞分化有有限分化无环境影响特别敏感敏感一般细胞壁无有有调整方式内部和外部内部和外部内部动物细胞培育：模拟动物体内生理环境使细胞分裂增殖的一种技术。特点：动物细胞培育（亦称组织
4、培育）既有别于植物细胞培育，又与微生物的培育完全不同。进化程度高、结构和成分更困难，功能也更全面。细胞培育：将动物组织或细胞分散成单个细胞，在模拟机体内的生长环境条件下，使其在体外环境下（in vitro)接着生长增殖的过程。组织培育：把生物机体内的组织、器官等在模拟体内环境的条件下使其存活、生长、繁殖、传代原代培育或初代培育:将机体取出的细胞或组织进行初次培育的过程。初次培育的细胞大约增殖10代左右，这样的细胞称为原代细胞。传代培育或继代培育:从原代培育的细胞接着转接培育称为传代培育。in vitro条件下持续传代培育的细胞称为传代细胞。Cell line:从原代培育产生的能进行无限次传代的
5、细胞群。体外培育的动物细胞生长方式1) 贴附生长：必需贴附于支持物表面才能生长，这种细胞叫贴壁依靠型细胞。 a.成纤维型细胞 b.上皮型细胞 c.游走型细胞 d.多形型细胞2) 悬浮生长：在悬浮状态下即可生长，不须要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。这种细胞叫非贴壁依靠型细胞。基本技术特点：对环境敏感；养分要求高；简洁污染。培育工具：试验室：培育皿、培育瓶，培育板工业化：如微载体。培育条件：7个1)无菌条件：取材之前最好用消毒液处理如75%的酒精消毒；处理材料的过程中在超净工作台里完成；培育的过程中可以添加肯定的抗生素；此外培育液也须要无菌。2）温度与多数哺乳动物体内温度相像，培育细
6、胞的最适温度为37oC+0.5oC。高温对细胞的威逼大。3）pH值细胞培育的PH最适为7.2一7.4间，当PH低于6.0 或高于7.6时，细胞的生长会受到影响，甚至导致死亡。但是，多数类型的细胞对偏酸性的耐受性较强，而在偏碱性的状况下则会很快死亡。4）气体细胞的生长代谢自然离不开气体，容器空间中的O2及CO2足以保证细胞体内的代谢活动的进行5）渗透压细胞培育液的渗透压应限制在300mOsm;6) 养分成分培育液里的成分要满意细胞进行糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢及核酸代谢所须要的各种组成，如包括十几种必需氨基酸及其它多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。常用的培育细胞的培育基：合成培育
7、基+自然培育基自然培育基：合成培育基无血清培育基7) 水的质量要求超纯水；至少要求3蒸馏水。培育箱二氧化碳培育箱：可满意pH,温度,饱和湿度等条件。细胞培育技术原代培育是指干脆从机体取下细胞、组织和器官后马上进行培育。通常把第一代至第十代以内的培育细胞统称为原代细胞。最常用的原代培育有组织块培育和分散细胞培育。原代培育的实质就是初次培育，培育细胞不再分割，不换器皿原代培育中的“代”非细胞的“代”数不分割培育物不等于不换培育液1） 组织块培育取材简洁培育的组织：幼体组织尤其是胚胎组织分化程度低的组织肿瘤组织留意：a.存放时间不宜过长（24h) b.严格无菌。 c.避开紫外照耀、接触化学试剂及有害
8、药物如碘、汞缺点：组织块有时候贴壁后简洁再重新悬浮起来；不能得到数量较多的细胞。优点：对细胞损伤小；细胞可从组织块四周长出来，细胞状态维持较好。实际应用较少。2) 组织消化培育（细胞培育）a、将从机体某部位取下的组织经无菌处理后先放入一个培育皿中用Hanks液洗3次无菌取材 b、然后用小剪刀剪成约1立方毫米的组织块 c、加入适量PBS,用吸管吹打洗涤处理材料 d. 加入消化酶消化组织块消化 e. 静止3-5分钟,收集上清液,细胞计数. f. 1200转/分钟, 离心5分钟使细胞沉淀所运用的消化液 a.胰蛋白酶-EDTA 0.25% 胰蛋白酶-0.04%EDTA,37搅拌消化5-10min适用：
9、细胞间质较少的软组织、传代细胞留意：钙、镁离子对其作用有抑止，配液时应留意; 血清可终止其作用 b.胶原酶消化法胶原酶（2000U/ml),pH6.5 36.5 148h适用：纤维组织、上皮组织、癌组织注：钙、镁离子对其作用无影响，血清不会抑活性g. 倒掉上清液, 收集沉淀的细胞h. 加入适量培育基,转移入培育瓶中培育 -培育优缺点刚好与组织培育相反2） 细胞传代方法依据细胞生长的恃点，传代方法有2种。 1. 悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培育液后再混匀传代。干脆传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培育液去除l2一23，然后用吸管干脆吹打形成细胞悬液再传代
10、。2. 贴壁生长细胞传代采纳酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。培育过程 a.接种培育,刚好更换培育液 b.常规检查 -检查细胞形态及活力(增殖实力）检查养分液pH及污染1）污染途径：操作方法、培育液、培育环境2）污染的来源：真菌污染；细菌污染；支原体污染3）污染的处理稍微污染: 可先用培育液冲洗细胞3-5遍,然后加2-3倍的抗生素于培育液中;贴附生长细胞的生长过程1潜藏期细胞游离、贴壁、起先生长2对数生长期-细胞快速生长3平台期-细胞停止生长3） 细胞冻存和复苏冻存和复苏的原则：慢冻快融细胞复苏方法（l）从液氮中取出冷冻管，快速投入3738 水浴中，使其溶化（1分钟左右）。（2
11、）5分钟内用培育液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加簇新培育液培育刚复苏的细胞。细胞冻存方法在细胞冻存时加入低温爱护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温爱护剂是DMSO，它是一种渗透性爱护剂，可快速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，削减胞内冰晶，从而削减冰晶对细胞的损伤。组织工程定义: 应用生命科学和工程学原理，单独或组合地利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或器官再生的一门技术。三要素1，种子细胞：自体分化细胞异体分化细胞干细胞自体分化细胞优点：自体细胞可避开受者免疫系统的排斥反应。缺点
12、：来源和数量有限，培育后老化异体分化细胞优点：有望可解决种子细胞来源问题。缺点：免疫排斥、携带潜在病毒干细胞最志向的种子细胞支架材料支架要求良好的组织相容性跟人体器官相容；良好的表面活性细胞简洁存活；具有可塑性（大部分）弹性较好；生物可降解性降解简洁；具有三维立体结构模拟体内环境；无毒。功能：为细胞供应生存空间；为细胞供应足够的养分成分和空气交换；使细胞三维生长。自然可降解生物材料包括胶原，壳聚糖，透亮质酸等。优点是无毒，亲细胞，简洁使细胞生长，增殖。缺点：重复性差，价格昂贵来源：结构分子：作用：用途：人工可降解生物材料包括聚乳酸，聚羟基乙酸，聚羟基丁酸酯等。无机材料n氧化铝陶瓷n玻璃陶瓷n羟
13、基磷石灰主要用于骨，牙齿硬质材料。复合材料3.细胞因子皮肤细胞工程干细胞具有自我更新和分化潜能的细胞分类胚胎细胞的培育技术形态：小鼠干细胞形态上通常呈圆形，体积小，核大，核质比高，核仁多。集落成鸟巢状。胚胎干细胞分化潜能的评价流程成体干细胞胚胎干细胞接着进行分化，形成具有特定功能的干细胞，这些特地化的干细胞统称成体干细胞。成体干细胞是指一群分布在成体组织或胎儿组织中尚未分化的、具有自我更新、并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞潜能的干细胞.几乎人体的任何一个组织和器官，均发觉相应的干细胞，如神经干细胞，造血干细胞，间充质干细胞，皮肤干细胞等一般特性：组织中的细胞数量少；但有不同于分化细胞的表
14、型特征；有很强的增殖实力，但一般不能在体外无限增殖；能分化成与该组织相关的分化细胞;致瘤性（？）。间质干细胞-一种具有临床价值的干细胞.定义存在于多种组织内的细胞亚群，细胞形态成纤维状，它们可以在体外扩增，在体外经诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、神经细胞等来源来源于中胚层，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，例如人的外周血，脂肪，皮肤，肌肉，脑，胎肾，甚至存在于胎盘和羊水中；其中以骨髓中最多。数量数量很少，混杂在其他成体细胞中间充质干细胞的基本生物学特性 4.1 形态单个细胞：呈成纤维外观，圆形或者纺锤形；其中以成纤维性居多；其中形态较小为增殖实力较强的干细胞；细胞群：呈集落状生长，细胞群呈心圆状或菊花状集落。间充质干细胞的基本生物学特性 4.2 表型特征 MSCs主要表达细胞表面蛋白CD105，CD73，CD90，不表达CD45，CD34等。但这些表型并不是MSCs所特有的。间充质干细胞的基本生物学特性 4.3 增殖潜能依据是自我更新，即单克隆形成实力；单细胞克隆实力越强，自我更新实力越强，增殖潜能越高。4.4 分化潜
