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1、实验一 糖和蛋白质的理化性质检验(4 学时)第一部分 蛋白质的理化性质第一节 蛋白质的颜色反应一、实验目的掌握鉴定蛋白质的原理和方法。二、实验原理蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不 同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一 反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果 决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。三、实验器材与试剂实验器材1. 鸡蛋 1 个2. 吸管 l.OmL (xl)3. 试管 1 .5cmx15cm (x2)4. 试管架5. 试管夹 2 个6. PH 试纸( 5-
2、7)7. 水浴锅实验试剂1. 卵清蛋白液：将鸡(鸭)蛋白用蒸馏水稀释 20-40 倍，离心，上清液冷藏备用。2. 1%茚三酮溶液： 1g 茚三酮溶于 95%乙醇并稀释至 100mL。3. 浓硝酸： 比重 1.42。4. 10%NaOH溶液：lOgNaOH溶于蒸馏水，稀释至100mL。四、实验方法A. 黄色反应蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。遇硝酸可硝 化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为橘黄色的硝苯衍生物（苯及苯丙氨酸较 难硝化，需用浓硫酸促进之。反应如下：i八划丨(VNOH I3操作方法：于一试管内，置蛋白质溶液 1O 滴及浓硝酸 5 滴，加热，冷却后 再加10%Na
3、OH溶液20滴，观察颜色变化。B. 茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及a -氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应。亚 氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色。操作方法：取1mL蛋白质溶液置于试管中，加3-5滴茚三酮试剂，加热至 沸，即有蓝紫色出现。注意：此反应必须在pH5 7进行。C双缩脲反应（参考实验）将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中， 能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有 肽键与缩脲结构相似，故能呈此反应（双缩脲反应可用以鉴定蛋白质是否完全水 解，
4、及用比色法作蛋自质之定量测定）。其反应式如下：OHOHNJ L:U门OC- NHjCu -X1 -z - m& +加理NH十M乐F:二&叫、E15TNR;CI 1 -l：2【rx:- HrNTh CO虬帚皿OH銅詁:-衣弗號堵件锹操作方法：1. 取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩脲， 释出之氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。 然后加 10NaOH 溶液 1mL 摇匀，再加 2 滴 1硫酸铜溶液，混匀，观察有无 紫色出现。2. 另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10%NaOH溶液10滴及1%硫 酸铜溶液 2 滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。
5、注意：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或 铵盐与铜盐作用，生成深蓝色的络离子Cu(NH3)42+,妨碍此颜色反应的观察。第二节 蛋白质的沉淀反应一、实验目的1. 熟悉蛋白质的沉淀反应。2. 进一步掌握蛋白质的有关性质。二、实验原理多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的 盐后，即产生沉淀。蛋白质沉淀分为可逆沉淀和不可逆沉淀。可逆沉淀是指沉淀 出来的蛋白质分子，内部结构改变很小或基本没有改变，仍然保持原来的生物活 性，只要消除沉淀因素，沉淀会重新溶解而成原来的胶体溶液。不可逆沉淀是指 沉淀出来的蛋白质分子，内部结构发生了较大的改变，蛋白质
6、已失去了原来的生 物活性，即使沉淀因素消失后，沉淀也不会重新溶解。三、实验器材与试剂实验器材1. 试管 1.5cmxl5cm (x5)。2. 吸管 5.0mL (x2), 2.0mL (x3), l.OmL (xl)。3. 玻璃漏斗5cm 1个。4. 滤纸9cml张。实验试剂1. 蛋白质试液：见蛋白质颜色反应实验中的卵清蛋白液。2. 硫酸铵晶体： 如颗粒太大，最好研碎。3. 饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100mL加硫酸铵至饱和(硫酸的饱和度：707g/1000mL)。4. 95乙醇。5. 结晶氯化钠。6. 1%醋酸溶液：冰醋酸1mL用蒸馏水稀释至100mL。7. 5%鞣酸溶液：5g鞣酸溶于水并稀释至
7、100mL。四、实验方法A. 蛋白质盐析作用向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为 盐析。操作方法：1. 取蛋白质溶液4mL,加入等量饱和硫酸铵溶液（此时硫酸铵的浓度为50% 饱和），微微摇动试管，使溶液混和静置数分钟，球蛋白即析出（如无沉淀可再 加少许饱和硫酸铵）。分取一半混合液，加水观察沉淀是否溶解。2. 将混合液的另一半过滤，滤液中加硫酸铵粉末（约0.8g）,至不再溶解， 析出的即为清蛋白。再加水稀释，观察沉淀是否溶解。注意： （1） 应先加蛋白质溶液，然后加饱和硫酸铵溶液；（2） 固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。B. 乙醇沉淀蛋白质乙
8、醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体质点的水化层而使其沉淀析出。操作方法:取蛋白质溶液1mL,加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全）， 待溶解后再加入95%乙醇3mL混匀。观察有无沉淀析出。C. 生物碱试剂沉淀蛋白质植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱（或植物碱）。能 沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨 酸等。生物碱试剂能和蛋白质结合生成沉淀，可能因蛋白质和生物碱含有相似的 含氮基团之故。操作方法：取1支试管，加入2mL蛋白质溶液及1%醋酸溶液4-5滴，向 一管中加 5鞣酸溶液 58 滴，观察结果。D重金属盐沉淀蛋白质（参考实验）蛋白质与重金属离子
9、（如Cu2+,Ag +, Hg2+等）结合成不溶性盐类而沉淀。 操作方法：取试管2支各加蛋白质溶液2mL, 一管内滴加1%醋酸铅溶液, 另一管内滴加1%CuS04溶液，至有沉淀生成。第二部分 糖的理化性质第一节 糖的颜色反应A 莫氏试验一、实验目的掌握莫氏（Molisch ）试验鉴定糖的原理和方法。二、实验原理糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与a萘酚生成紫红色缩合物。利用这一性质可以鉴定糖。戊糖HO-C-HCltOTT40FT ： - Of I匸HO-C-HJ/.：H -C-OJIHO-C 11三、实验器材与试剂实验器材1. 棉花或滤纸。2. 吸
10、管 l.OmL (x4)、2.0mL (xl)。3. 试管 l.5cmxl5cm (x4)。4. 水浴锅实验试剂1. 莫氏试剂：称取a-萘酚5g,溶于95%乙醇并稀释至lOOmLo此试剂 需新鲜配制，并贮于棕色试剂瓶中。2. l%蔗糖溶液：称取蔗糖lg,溶于蒸馏水并定容至lOOmL。3. l%葡萄糖溶液：称取葡萄糖lg,溶于蒸馏水并定容至lOOmL。4. l%淀粉溶液：将lg可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混和成薄浆状物，然后 缓缓倾入沸蒸馏水中,边加边搅,最后以沸蒸馏水稀释至 lOOmL。5. 浓硫酸四、实验方法于4支试管中，分别加入lmL l%葡萄糖溶液、l%蔗糖溶液、l%淀粉溶液 和少许纤维素(
11、棉花或滤纸浸在lmL水中)，然后各加莫氏试剂2滴，摇匀，将 试管倾斜，沿管壁慢慢加人浓硫酸l.5mL (切勿振摇！)，硫酸层沉于试管底部与 糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫红色环出现。注意：1. 一些非糖物质(如糠醛、糖醛酸等)亦呈阳性反应。此外，样液中如含 高浓度有机化合物，将因浓硫酸的焦化作用，而出现红色，故试样浓度不宜过高。2. 亦可用麝香草酚或其他苯酚化合物代替a -萘酚，麝香草酚的优点是溶液 比较稳定，且灵敏度与萘酚一样。3. 莫氏试剂应直接滴入试液中，勿使试剂接触试管壁，否则试剂会与硫酸 接触生成绿色而掩盖紫色环 。B. 杜氏试验一、实验目的掌握杜氏(Tollen )试验鉴定戊
12、糖的原理和方法。二、实验原理戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质：本 试验虽常用以鉴定戊糖，但并非戊糖特有反应。果糖、半乳糖和糖醛酸等都呈阳 性反应。戊糖反应最快，通常在 45s 内即产生红色沉淀。三、实验器材与试剂实验器材1. 吸管 l.OmL (xl)2. 试管 1.5cmx15cm (x3)3. 水浴锅。实验试剂1. 杜氏试剂：1%间苯三酚乙醇溶液(2 g间苯三酚溶于100mL95%乙醇中) 3mL,缓缓加入浓盐酸15mL及蒸馏水9mL即得，临用时配制。2. 1%阿拉伯糖溶液：称取阿拉伯糖1g,溶于蒸馏水并稀释至100mL。3. 1%葡萄糖溶液：见试验A。4.
13、1%半乳糖溶液：称取半乳糖1g,溶于蒸馏水并稀释至100mL。四、实验方法于3支试管中各加入杜氏试剂ImL,再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1% 半乳糖溶液和1%阿拉伯糖溶液，混匀。各试管同时放入沸水浴中，观察颜色变 化并记录颜色变化时间。C. 塞氏试验 (参考实验)一、实验目的掌握塞氏(Seliwanoff)试验鉴定酮糖的原理和方法。二、实验原理酮糖在浓酸的作用下,脱水生成 5 一羟甲基糠醛,后者与间苯二酚作用,呈 红色反应； 有时亦同时产生棕色沉淀,此沉淀溶于乙醇,成鲜红色溶液。以糖 为例,其反应如下。IT C -01；H-C-Oli三、实验器材与试剂实验器材1. 移液管 0.5mL (x3
14、), 5.0mL (xl)2. 试管 1.5cmx15 cm (x3)。3. 水浴锅。实验试剂1. 塞氏试剂：溶50mg间苯二酚于100mL盐酸中(V (H2O) :V (HCl) = 2:1),临用时配制。2. 1%果糖溶液：称取果糖1g,溶于蒸馏水并定容至100mL。3. 1%葡萄糖溶液：见试验 A。4. 1%蔗糖溶液：见试验 A。四、实验方法于 3 支试管中分别加入 1% 葡萄糖溶液、 1%蔗糖溶液和 1% 果糖溶液各0.5mL，各加塞氏试剂2.5mL，摇匀，同时置沸水浴内。比较各管颜色变化及红 色出现的先后次序。注意:在此实验条件下，蔗糖有可能水解成果糖与葡萄糖，而呈阳性反应。葡萄糖与
15、麦芽糖亦呈阳性反应，但呈色反应的速度较酮糖缓慢。果糖的红色出现及沉淀的产生，应在加热后20-30s内，生成的沉淀能溶于乙醇并成红色溶液。第二节 糖的还原作用、实验目的掌握用糖的还原反应来鉴定糖的原理和方法。二、实验原理费林（Fehling）试剂和本尼迪特（Benedict）试剂均为含Cu24的碱性溶液, 能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身则被还原成红色或黄色的Cu2O （由 于沉淀速度不同，形成的颗粒大小不同，颗粒大的为红色，小的为黄色。）此法常用作还原糖的定性或定量测定。 其反应表示如下：2CuSO4NaOHHC-0KLUQI:II|HC- 0H1i(CHOH(iCHOH),1|烯一醇2Na2SO4 +
