重组质粒酶切与PCR验证

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1、重组质粒的酶切和 PCR 验证1、学习和利用限制性内切酶酶切检验重组质粒插入片段的方法；2、复习限制性内切酶酶切原理和方法；3、学习和掌握 PCR 反应的基本原理和实验技术；4、学习利用 PCR 方法检验重组质粒插入片段的方法；5、了解引物设计的基本要求；【实验原理】1、重组质粒是外源基因通过单酶切与用相同的限制性核酸内切酶切割的质 粒载体连接后获得的，因此在连接处仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列， 用该酶再次切割重组质粒，能把插入片段切离载体，根据琼脂糖凝胶电泳检测 可见有载体片段和插入的外源 DNA 片段，并可知插入片段的大小。2 、聚合酶链式反应( Polymerase chain r

2、eaction )，即 PCR 技术是一种 体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。PCR的 反应组分包括：模板DNA、寡核苷酸引物、Mg2弋4中脱氧核糖核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适合的缓冲体系等。反应包括DNA变性，引物复性和 引物延伸三个基本过程。DNA变性，即在90-95高温下，加热使模板DNA双 链解离，形成两条单链DNA；引物复性，又称为引物退火。将反应温度降 低，使两个引物分别与变性的单链靶DNA特定部位结合形成部分双链DNA； 引物延伸，即在60-72以及四种脱氧核糖核苷三磷酸存在的条件下，由DNA 聚合酶催化，以单链靶DNA为模板，根据碱基配

3、对原色，在引物3端掺入 dNTP合成新的DNA互补链，产生新的双链DNA。3、PCR反应有两个重要特征：一是经PCR扩增后，扩增产物片段在大小由 两个引物与模板的结合位点决定；二是经过PCR扩增，产物以指数级数增加， 可达到目的片段的大量扩增。在此实验中PCR技术实际上是在模板DNA、引物 和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR 技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。4、寡核苷酸引物或称PCR引物，是指两段与待扩增的目的DNA序列两侧翼 片段互补的一段单链寡核苷酸序列。一个普通的PCR反应中应包括两条引物， 一条为上游引物(或正向引物)，一条称为下游

4、引物(或反向引物)。两条引 物分别与DNA双链中的一条链相对应。引物设计的目标要在两个主要指标，即 扩增的特异性和扩增效率上取得平衡。一般引物设计可以遵循以下规则：A. 长度：一般为18-24个碱基。每增加一个核苷酸，引物特异性增加四 倍，但同时增加了引物的 Tm 值以及合成成本。B. 碱基组成： G+C 百分含量在 40%-60%，四种碱基最好随机分布，尤其 3 端避免超过3个连续的G或C，否则会使引物在G+C富集区产生错误引发。C. 单条引物内部避免有二级结构，引物自身不能有连续4个碱基的互补。D. 两条引物之间最好不能有超过连续4个碱基的互补，3端不存在互补序 列，还要避免 3端的 G

5、碱基串和 C 碱基串。E. 引物序列最好由1-2个G或C碱基起始，也以1-2个G或C碱基结束。F. 熔解温度：Tm是寡核苷酸的解链温度，即在一定的盐浓度下，50%寡核 苷酸双链的解链温度。PCR反应中的有效复性启动温度，一般低于Tm 5-10C。G. 两个引物应当具有相近的Tm,相差应小于5C。因此，上下游两个引物 之间长度应相差小于3bp。H. 引物的 5端可以被修饰，对扩增的特异性影响不大。I引物3端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3端开始的。J.在扩增基因编码区域是，引物3端要避开密码子的第3位，因为密码 子第 3 位易发生简并，会影响扩增的特异性和效率。5、 标准PCR的基本程

6、序为：模板DNA的预变性 T5-35次循环 戶物 的终延伸。预变性的目的是为了在开始PCR循环之前，使模板DNA充分地变 性。终延伸步骤的目的是为了使在最后一次循环中起始的合成片段都能够完成 延伸。6、反应有三个基本步骤：(1) 变性(denaturation):通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解 离形成单链DNA。变性温度一般情况选择94C, 30秒可使各种复杂的DNA分子 完全变性。在本实验中，根据选择的模板，选择3min的变性时间。(2) 退火(annealling):当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要 复杂的多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的

7、 模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。复性温度的选 择，可经根据引物的长度和其G+C含量确定，在Tm允许的范围内，选择较高的 退火温度可大大减少引物和模板之间的非特异结合，提高PCR反应的特异性。 退火时间设置为 30秒钟，足以使引物和模板之间完成结合。(3) 延伸(extension):在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物 及Mg离子存在的条件下，5 -3的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延 伸反应。PCR反应的延伸温度建议选择在7075C之间，实验中选择72Co以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小 时之后，介于两个引物之间的特异性D

8、NA片段得到了大量复制，数量可达 2X1067拷贝。理论上说2025次循环后，PCR产物的积累即可达最大值， 实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少， 2030 次是比较合理的循环次数。循环反应的次数越多非特异性产物的量亦会 增加。7、PCR反应可以用来鉴定载体上是否重组了外源DNA片段并可估测外源插 入片段的大小。根据载体多克隆位点上下游基因的序列设计一对PCR引物，两 引物之间的距离即是空载体PCR扩增的大小，如果在多克隆位点内插入外源 DNA 片段，就会改变 PCR 扩增产物的大小，扩增产物的大小减去两引物之间的 距离即是插入片段的长度。也可以直接基于外源

9、DNA两端的序列设计一对引物 分别以空载体和重组质粒为模板进行 PCR 反应，只有重组质粒能扩增出一定大 小的产物，则该产物的大小即是插入片段的大小。8、隆基因或片段的初步验证：如以 pUC19 为载体构建的重组质粒为模板， 根据 pUC19 载体多克隆位点两侧的已知序列，设计一对引物，建立 PCR 反应， 可以对克隆于 pUC19 载体多克隆位点的目的基因或者 DNA 片段进行扩增。通过 产物检测初步验证重组质粒的构建是否成功。PCR 引物信息：引物名称引物序列5-3引物长度（mers）Tm(C)M13F(-47)CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC2464.7CM

10、12R(-48)AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA2457.9 CPCR扩增产物的长度（bp） =150+插入片段的长度【实验试剂与仪器】1、实验试剂：1XTAE电泳缓冲液，上样缓冲液（6Xloading buffer），琼脂糖，溴化乙锭（EB）,入-Hind III DNA Marker, pUC19/Hind III DNA Marker,DL2000 plus DNA Marker, ddH O, Hind III, Taq DNA 聚合酶，缓冲2液, dNTP 混合物2、实验仪器：37C恒温水浴锅，PCR仪，-20t冰箱，1.5mL离心管，不同型号枪 头,微

11、量移液器,微波炉,电泳仪,制胶槽,电泳槽,梳子,锥形瓶,电子天平,一 次性手套，凝胶成像仪【操作步骤】一、 重组质粒的酶切验证根据之前重组质粒电泳图判断我组插入片段大小约为6.5kb和2.0kb, 采用Hind III酶切进行验证。我组重组质粒R1较大且数目较多，R2片段中等 产量中等，设计酶切反应体系如下：成分及加样顺序重组质粒R1 体系（L）重组质粒R2 体系（L）ddHO27.28.510XM Buffer1.01.2Re- pUC191.01.5Hind K15U/p L)0.80.8总计10121 、按顺序加入各成分，用枪吹打混匀；2、快速离心集液于管底；3、37C反应 2h, -2

12、0C保存；4、重组质粒酶切电泳检测（1.2%琼脂糖凝胶）120V,50min。二重组质粒的PCR验证由于我组重组质粒插入片段均在2.0kb以上，所以用老师提供模板进行PCR检测。PCR反应体系如下:组分加量（卩L）ddH2O13.610X Buffer2.0dNTP (2.5mM each)1.6M13F (10p M)0.8M13r (10p M)0.8模板(1-10ng/p L)1.0Taq 酶(5U/p L)0.2总体积20.01、在冰浴中加入以上成分，用枪吹吸混匀2、快速离心集液于管底；3、PCR 反应，反应程序如下:项目温度时间循环预变性94C3min变性94C30s30 cycle

13、s复性58C30s延伸72C60s终延伸72C10min保存4C2hr4、电泳检测PCR产物。【实验结果及分析讨论】一、重组质粒酶切电泳检测12345 6789 10 11 12 13 14 15 16 17 18bp5642313094166557436123222027图1.质粒Hind III酶切凝胶电泳检测图备注：1. 入-Hind III DNA marker2.3.5.7.9.1.0 L4.sk8 R1/Hind I上样量：20 L1.0 L6.sk8 R2/Hind I上样量：20 L1.0 L8.sk9 R1/Hind I上样量：20 L1.0 L10.sk9 R2/Hind

14、I上样量： 20 L1.0 L12.sk8 R1/Hind I上样量： 20 L1.0 L14.sk8 R2/Hind I上样量： 20 L重组质粒 R1 上样量： 重组质粒 R2 上样量 重组质粒 R1 上样量 重组质粒 R2 上样量上样量：10L 上样量：5p L上样量： 10 L18.空pUC19/Hind I DNA marker sk8 sk8 sk9 sk911.sk12 重组质粒 R1 上样量13.sk12 重组质粒 R2 上样量15.空 16.入-Hind III DNA marker17. DL2000 DNA marker 上样量： 5 L分析：1. 3、4泳道为我组重组质

15、粒R1及R1/Hind III酶切样品。对比第2泳道 pUC19/Hind I DNA marker 可知，第 4 泳道靠下一条亮带是酶切出的 pUC19， 而上面一条亮带则是插入的入-Hind III DNA片段。将插入片段与入-Hind III DNA marker 比较可知，插入片段大小约为 6500bp。2. 5、6泳道为我组重组质粒R1及R1/Hind III酶切样品。对比第5泳道 pUC19/Hind I DNA marker 可知，第 6 泳道靠上一条亮带是酶切出的 pUC19， 而下面一条亮带则是插入的入-Hind III DNA片段。将插入片段与入-Hind III DNA marker 比较可知，插入片段大小约为 2000bp。3. 从