人类Kras基因突变检测试剂盒说明书

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1、人类Kras基因突变检测试剂盒说明书人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书【产品名称】通用名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲 线法）英文名：Diagnostic kit for Mutations of Human Kras Gene （PCR-Melting Curve Analysis）【包装规格】20 测试/盒【预期用途】K-ras 基因位于 12 号染色体短臂上，是重要的癌基因之一， 编码一种 21kD 的 kras 蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包 括 PI3K/PTEN/AKT 和 RAF/MEK/ERK 信号转导途径，这些转导途 径是当前

2、肿瘤靶向药物研究的热点，靶向药物经过抑制这些途径 发生药理作用。K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致 kras 蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。据中国 肿瘤学临床实践指南，在一项包含 101 例肺腺癌亚型细支气 管肺泡癌患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一 线治疗。K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者 则 有 20 例 缓 解 （ 20/62 ， 32% ） ， 差 别 有 统 计 学 意 义 （P AGTGlyl3SerGGOAGCGlyl2ArgGGTCGTGfyBAigGGOCGCGLyl2CysGGTTGTGlyl3CysGGOT

3、GCGlyl2AspGGTGATGlyl3AspGGCGACGlyliAlaGGT GCTGlylSAlaGGOGCCGLyl2ValGGTGTTGtyl 3ValGGOGTC【检验原理】本试剂盒基于实时 PCR 平台，结合了特异引物、荧光探针和 熔解曲线技术，定性检测DNA样品中K-ras基因12,13密码子是 否存在突变。用一对K-ras基因特异引物，该引物可扩增12种突 变型和野生型的 K-ras 目标序列，利用标记了 FAM 荧光基团和淬 灭基团的双标记探针一方面抑制野生型基因的扩增，提高突变基 因的检测灵敏度，另一方面在扩增后用熔解曲线法实现对扩增产 物的分析，荧光探针在未杂交时因荧

4、光基团和淬灭基团相互接近 而被淬灭，不发荧光，杂交状态时，二者相互离开而产生荧光。 该荧光探针分别与突变基因和野生型基因的杂交产物在熔解曲线 分析时，表现为熔解曲线导数图中出现不同位置的峰，熔解峰对 应的位置即为熔解温度（Tm值），因野生峰的位置较突变峰位置 大3C以上而得到区分，但各种突变峰因Tm值相差较小而不能辨 别。本品可稳定地检出野生型 10ng/ul 基因组背景下 1%含量的体细胞突变，其熔解曲线会出现双峰，其中突变峰较野生峰 Tm 值明显降低（图 1）。0.045图1系列阳性样本的检测结果注：左峰为突变峰右峰为野生峰0.Sfe0.4主要组成成份】本试剂盒包含PCR反应液I、PCR反

5、应液II和野生型对照品等 3管试剂。PCR反应液I包含相应的K-ras基因突变检测引物和探 针，探针由FAM荧光指示；PCR反应液II含有dNTP、Taq酶和 MgCl2 等。表2试剂盒组成试刑组分体积主要成分PCR反应液I350pl25-125pMJ引物利探针O.lUplTaq 酶和 30nMdNTP.PCR反应液IIlOOpl75DnMMg2-等野生型対照吊20illDno/ulF牛型慕國组DNA检测必须但试剂盒中不包含的组分：1.5ml 离心管（用于配制 PCR 反应液和 DNA 提取）；0.2ml PCR 管或 8 联 PCR 管或 96 孔 PCR 板； 带滤塞的吸头（lml、200

6、 l 和 10l）；DNA 提 取 试 剂 盒 ReliaPrep FFPE gDNA Miniprep System （货号：A2352）【贮存条件及有效期】置于-20C条件下储存，有效期6个月4-10C避光条件下储存或运输不得超过7 天。适用仪器】适 用 于 ABI7500 、 Linegene FQD-96A 型 号 的 Realtime PCR 扩增仪。【样本要求】1. 适用样本为非小细胞肺癌、结直肠癌石蜡包埋病理组织 切片，切片厚度10m，数量1片，所用切片样品保存不超过3 年。2. 由于肿瘤的复杂性，所采集的临床样品往往会混有正常 组织细胞，石蜡包埋病理切片样品肿瘤病变细胞应不低于

7、 %，所取部分应尽量在蜡块中部；3. 使用商业化的试剂盒来提取人类基因组DNA，推荐使用Promega 公司的 ReliaPrep FFPE gDNAMiniprep System (A2352)提取石蜡包埋组织切片样品，所 提 DNA 需 用 紫 外 分 光 光 度 计 测 定 浓 度 和 纯 度 ， 其 DNA OD260/OD280 的值应在 1.82.0，浓度应在 3300ng/l 之 间，样本 DNA 质量不合格者不得用于检测，建议重新取切片进行 核酸提取，提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20C以下 保存，保存时间不要超过 6 个月。【检验方法】一、核酸提取（样本处理室）使

8、用 ReliaPrep FFPE gDNA Miniprep System 进行核酸 提取，提取步骤如下。1. 用矿物油去除石蜡加矿物油500M到装有组织切片样本的1.5ml离心管内， 80C孵育1min，振荡混匀；2. 组织样本裂解，消化组织蛋白质1）离心管内加入200M裂解液，室温10,000g离心15s,形成水 油两相溶液，下层为水相，上层为油相；2）向离心管水相加入20M蛋白酶K,用移液枪吸打混匀； 3）56C 孵育 1h；4）80C 孵育 1h；5）冷却到室温，离心 15s；3. 去除 RNA向离心管水相加入10M RNase A,吸打混匀。室温（20- 25C ）孵育5min； 4

9、.用核酸提取柱提取基因组DNA1）加入 220M BL Buffer到含裂解样品的离心管中，再加入240M乙 醇（95-100%），震荡混匀，室温10,000g离心15s，形成水油两 相溶液，下层为水相，上层为油相；2） 将结合柱置于收集管内，小心吸取离心管下层水相（包括可 能形成的沉淀）转移到结合柱内，盖上管盖，将离心管丢弃。3）收集管室温10,000g离心30s,弃去管中的滤出液。4）把柱子重新装入收集管中，加入500 U1 1 洗涤液至 柱内，室温10,000g离心30 s,弃去滤出的洗涤液。5）重 复步骤4）再洗涤一次；6）打开结合柱盖子，室温条件下16,000g离心3 min以甩干柱

10、内残余的液体；7）把柱子转移至一个干净的自备1.5ml离心管中，向柱内加入50l Elution Buffer，室温 16,000 g 离心 1 min洗脱基因组DNA，丢弃提取柱。注意事项：1. 操作提取柱和收集管时应戴好一次性手套；2. 收集基因组DNA前的16,000g离心3 min操作必须开盖，以 除净乙醇，乙醇残留过量将严重影响基因组的收集质量。二、试剂准备（试剂准备室）将试剂从冰箱取出，室温融化，混匀，1000rpm快速离心20秒，备用；三、反应体系配制（试剂准备室）1. 根据检测样本数计算所需反应数，如样本数为n，则需做n+2个反应（包含一个阴性对照反应和一个 无模板对照反应）；

11、2. 根据表 3 计算所需各反应液的体积，并配制反应体系，反 应体系混匀后 3000rpm 快速离心 30 秒，分装至 PCR 管中，每管 18ul；表吝加样表组分1反应（plPCR反应液I1414 XNPCR反应液II44-XN总休积1K18 XN四、加样（样本处理室）取2l提取的样品DNA加入PCR反应管，盖上管盖,1000rpm 离心或轻甩，排除管底气泡；阴性对照反应所用模板为 试剂盒中野生型对照品，空白对照反应所用模板为超纯水（自 备）。五、上机检测（扩增室）1. 将PCR管按顺序放入PCR仪，设置反应程序（1）LineGene FQD-96A荧光定量PCR仪程序设置m-20 话憾解曲

12、錢图3 ABI7500 PCR仪反应參数设置图Melt分析时，选择StepAndHold模式，温度3965C，每个 步骤升高0.3C，在每个温度都收集荧光。荧光检测通道选择FAM检测通道。2. 运行PCR反应程序，保存文件。六、结果获取荧光定量 PCR 仪运行结束后，使用配套软件对本次试验的结果进 行熔解曲线导数图（-dF/dT）分析。【参考临界值】以野生型对照品反应管为参照，以野生型对照峰峰高的 1/5 划定 阈值线。【检验结果的解释】1. 空白对照在 Linegene FQD-96A 中应无明显熔解峰，若分析 后出现明显熔解峰，可能为试剂受到污染或操作过程中的污染， 请排除污染源后重新检测

13、；在 ABI7500 中，空白对照荧光变化曲 线（Normalized Reporter）应为逐渐上升的一条斜线（如图4），若出现荧光值下降的熔解特征曲线，可能为试剂受到污染或 操作过程中的污染，请排除污染源后重新检测；2. 野生型对照管在熔解曲线分析后应有单独熔解峰，若野生型 对照管无熔解峰，或出现 2 个或 2 个以上熔解峰，该批次样本需 重新检测。请确认所使用的试剂是否仍在有效期内，确定操作是 否严格按照说明书进行。3. 若满足 1 和 2 要求，表明此次实验成功，对样品管进行分 析：（1） 样品管只出现单独熔解峰，且 Tm 值在野生型对照管熔解 曲线峰Tm 1范围内，该样本判定为阴性（野生型），如图5 野生峰；（2）样品管只出现单独熔解峰，且 Tm 值小于野生型对照管熔 解曲线峰Tm值3C以上，则该样本判定为阳性（突变型），如图5 突变峰；（3）样品管出现两个熔解峰，且两个熔解峰分别符合（ 1）和（2）的要求（如图6A），或样品管出现一个宽峰（左右各有一个高点，能够判为峰值，但两峰间平缓过渡，凹陷不明显，见图6B、C和D），则该样本判定为阳性（突 变型）；（4）一般