SC_T 3060-2023 鳕鱼品种的鉴定 实时荧光PCR法.docx

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1、SC/T鳕鱼品种的鉴定实时荧光PCR法范围本文件描述了以实时荧光PCR法测定鳕鱼源性成分的原理、仪器设备、试剂和材料、样品制备、DNAD提取、NA纯度和浓度测定、测定方法、结果判定与表达、防污染措施.GG(iPtA(iiTRiLlDst(st本文件适用于鳕鱼及易混鱼产品的定性检测.包括太平洋鳕鱼(adusmacrocephalus)、大西洋鳕鱼(adusmorhua)、黑线鳕Melanogrammusaeglefnu)、绿青鳕(olachiusvirens)、蓝鳕Micromessiuspoutassou)、细鳞壮鳕(lbatrossapectorals)、狭鳕(heragrachalcogr

2、amma)、阿根廷无须鳕Merlucciushubbs)等鳕鱼,以及棘鳞蛇鲭(uvetuspretosus)、异鳞蛇鲭(epidocybiumfavobrunneum)、小鳞南极犬牙鱼(isosichuseleginoides)、莫氏南极犬牙鱼Disosichusmawsoni)、裸盖鱼Anoplopomaifmbria)等鳕鱼易混品种.本文件不适用于混合样品.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.GB/T分析实验室用水规格和试验方法P

3、GB/T􀆰转基因产品检测实时荧光定性聚合酶链式反应(CR)检测方法GB/T实验室质量控制规范食品分子生物学检测术语和定义GB/T􀆰界定的术语和定义适用于本文件.缩略语下列缩略语适用于本文件.bBSA:牛血清蛋白(ulserumalbumin)cciaclCO:细胞色素氧化酶亚基(ytochromeoxidasesubuni)CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(etylrthylmmoniumbromide)Ct:循环阈值(ycethreshold)cCytb:细胞色素b(ytochromeb)diiidilDNA:脱氧核糖核酸(eoxyrbonulecacd)D

4、Nase:脱氧核糖核酸酶(eoxyrbonucease)diididiidATP:脱氧腺苷三磷酸(eoxyadenosnetrphosphate)dCTP:脱氧胞苷三磷酸(eoxycytdinetrphosphate)dGTP:脱氧鸟苷三磷酸(eoxyguanosnetrphosphate)diliideeaicliiitdNTP:脱氧核苷酸三磷酸(eoxyrbonuceosdetrphosphate)dTTP:脱氧胸苷三磷酸(eoxythymidinetrphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(thylnediminetetraacetcacd)FAM:羧基荧光素(arboxyfuore

5、scen)IU:酶活国际单位(nternatonaluni)MGB:小沟结合物(minorgroovebinder)iipPCR:聚合酶链式反应(olymerasechanreacton)SC/TcROX:羧基X罗丹明(arboxyXrhodamine)slisTiSNP:单核苷酸多态性(inglenuceotdepolymorphim)Taq:水生栖热菌(hermusaquatcu)itihaTrs:三(羟甲基)氨基甲烷rs(ydroxymethyl)minomethaneiiSrRNA:S核糖体RNA(SrbosomalRNA)SrRNA:S核糖体RNA(SrbosomalRNA)鳕鱼及其

6、易混品种􀆰鳕鱼f本文件中指鳕形目(Gadiormes)鱼类,主要指商业化捕捞、加工与贸易中常见的鳕科(Gadidae)、长尾ili鳕科(Macrourdae)、无须鳕科(Meruccidae)的主要品种.􀆰油鱼Ri本文件中指鲈形目带科棘鳞蛇鲭属的棘鳞蛇鲭(uvetuspretosus)及异鳞蛇鲭属的异鳞蛇鲭Ll(epidocybiumfavobrunneum).切片后商品形态与鳕鱼类似,市场俗称油鱼.􀆰银鳕鱼Dst(Dst本文件中指商业化捕捞、加工与贸易中常见的鲈形目南极鱼科犬牙南极鱼属的小鳞南极犬牙鱼(isosichuseleginoid

7、es)、莫氏南极犬牙鱼(isosichusmawsoni),鲉形目黑鲉科裸盖鱼属的裸盖鱼Anoiplopomafmbria),市场俗称银鳕鱼.裸盖鱼也俗称黑鳕鱼.原理针对鳕鱼及其易混品种的特异性基因片段设计引物与探针,通过分析实时荧光PCR扩增曲线与Ct值,对鳕鱼及其易混品种进行定性判定.仪器设备􀆰实时荧光PCR仪.􀆰离心机:转速不小于r/min.􀆰核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.􀆰天平:感量􀆰g.􀆰恒温水浴锅.􀆰高压灭菌锅.􀆰涡旋振荡器.Й

8、008;微量移液器.试剂和材料除另有规定外,所用试剂均为分析纯;实验用水为GB/T中规定的一级水;所用试剂、材料均应不含DNA和DNase.􀆰试剂􀆰􀆰苯酚.􀆰􀆰浓盐酸.􀆰􀆰氯仿.􀆰􀆰异戊醇.􀆰􀆰异丙醇.􀆰􀆰无水乙醇.SC/T􀆰􀆰CTAB.􀆰􀆰氯化钠.􀆰􀆰Tr

9、isbase.􀆰􀆰NaEDTA.􀆰􀆰蛋白酶K:IU/mg.:􀆰􀆰热启动TaqDNA聚合酶IU/L.􀆰􀆰氯化钾.􀆰􀆰硫酸铵.􀆰􀆰七水硫酸镁.􀆰􀆰TritonX.􀆰􀆰BSA.􀆰􀆰dNTP.􀆰􀆰dATP.􀆰􀆰d

10、CTP.􀆰􀆰dGTP.􀆰􀆰dTTP.􀆰􀆰ROX.􀆰溶液􀆰􀆰􀆰mmol/L氯化钾溶液:用mL水溶解􀆰g氯化钾(􀆰􀆰)并定容至mL,高压灭菌.􀆰􀆰􀆰mmol/L硫酸铵溶液:用mL水溶解􀆰g硫酸铵(􀆰􀆰)并定容至mL.􀆰􀆰

11、049008;mmol/L硫酸镁溶液:用mL水溶解􀆰g七水硫酸镁(􀆰􀆰)并定容至mL,高压灭菌.􀆰􀆰􀆰mmol/LTrisHCl溶液:用mL水溶解􀆰gTrisbase(􀆰􀆰),用浓盐酸(􀆰􀆰)调pH至􀆰,用水定容至mL,高压灭菌.􀆰􀆰􀆰mmol/LdATP溶液:取􀆰gdATP(􀆰⣺

12、08;),用水溶解并定容至mL.􀆰􀆰􀆰mmol/LdCTP溶液:取􀆰gdCTP(􀆰􀆰),用水溶解并定容至mL.􀆰􀆰􀆰mmol/LdGTP溶液:取􀆰gdGTP(􀆰􀆰),用水溶解并定容至mL.􀆰􀆰􀆰mmol/LdTTP溶液:取􀆰gdTTP(􀆰􀆰),用水溶解并定容至mL./

13、49008;􀆰􀆰mmol/LdNTP溶液:取􀆰mL􀆰mmol/LdATP溶液(􀆰􀆰)、􀆰mL􀆰mmol/LdCTP溶液(􀆰􀆰)、􀆰mL􀆰mmolLdGTP溶液(􀆰􀆰)与􀆰mL􀆰mmol/LdTTP溶液(􀆰􀆰)混匀.􀆰􀆰乙醇:量取mL无水乙醇

14、(􀆰􀆰)与mL水混匀.􀆰􀆰苯酚氯仿异戊醇混合液:量取mL苯酚(􀆰􀆰)、mL氯仿(􀆰􀆰)与mL异戊醇(􀆰􀆰)混匀,静置h.􀆰􀆰TritonX溶液:取LTritonX(􀆰􀆰)与􀆰mL水混匀.􀆰􀆰mg/mLBSA溶液:取􀆰gBSA(􀆰􀆰)用水溶解

15、并定容至mL.􀆰􀆰CTAB裂解液:用mL水溶解􀆰gCTAB(􀆰􀆰)、􀆰g氯化钠(􀆰􀆰)、􀆰gTrisbase(􀆰􀆰)、􀆰gNaEDTA(􀆰􀆰),调节pH至􀆰,用水定容至L,分装后高压灭菌.􀆰􀆰CTAB沉淀液:用mL水溶解􀆰gCTAB(􀆰􀆰)

16、、􀆰g氯化钠(􀆰􀆰),用水定容至L,分装后高压灭菌.􀆰􀆰mg/mL蛋白酶K溶液:用mL水溶解􀆰g蛋白酶K(􀆰􀆰),用水定容至mL,分装后PA()􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺Й

17、018;􀆺􀆺CAN()􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺SC/T保存于,避免反复冻融.(ii􀆰􀆰􀆰mol/L氯化钠溶液:用mL水溶解􀆰g氯化钠(􀆰􀆰)并定容至mL,高压灭菌.􀆰􀆰反应预混液):取􀆰L热启动TaqDNA聚合酶(􀆰􀆰)、􀆰L氯化钾溶液(􀆰􀆰)、􀆰L硫酸铵溶液(􀆰􀆰)、􀆰L硫酸镁溶液(􀆰􀆰)、􀆰LTrsHCl(􀆰􀆰)、􀆰LTrtonX