MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项

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1、MTT 配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项MTT是什么MTT 是一种粉末状化学试剂，全称为 3-（4,5）-dimethylthiahiazo （-z-yl）-3,5-di- phen ytet razoliumromide，汉语化学名为 3-（4, 5-二甲基噻唑-2）-2， 5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一 种黄颜色的染料。（可参考Sigma，货号M5655, Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide）二、MTT 法用来做什么 简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT 主要有两个用途1 药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细

2、胞毒 性的测定；2细胞增殖及细胞活性测定。三、为何 MTT 可以用来做上述工作 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为 水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞 无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内， MTT 结晶形成 的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（0D值），来判断活细胞 数量， OD 值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物 毒性越小）。四、实验所需材料1. MTT溶液的配制通常MTT配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生 理盐水做溶剂

3、。市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人 建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如 100mg用20mlPBS来溶解。具休做法：预先在50ml离心管（没有的 话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000U1 PBS 装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再 混匀。可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全 混匀后，用0.22“m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光（避光 袋或是黑纸、锡箔纸包住）可长期保存于-20 度。按细胞培养板每

4、孔 需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分 装 1ml 。1.2 对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装 在 EP 管里，用的时候现配，直接往培养板中加。、，、-、尸 I f r 丫 :注意事项：l 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。l配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感l MTT 一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过 4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml 保存在-20 度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋 或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当 MTT 变为灰绿色时就绝对

5、不 能再用。l MTT 有致癌性，用的时候小心, 有条件最好带那种透明的簿膜手套. 2MTT 甲瓒溶解液2.1二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解 速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过 程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。2.2三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml, 10M HCl 0.1ml用双蒸水溶解配成 100ml 溶液（文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT 方法，中国医药工业杂志， 1993， 24（10）： 455-457），该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。（个人觉得其溶解的能力不如DMSO 强）该溶解液因含有SD

6、S,在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前 必须提前几小时拿至室温，将 SDS 结晶全部溶解后再使用（五、MTT法实验步骤1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10X104/ml细胞详细计数方法请参照 中的相关文章（ 对于初学者而言，要使细胞达到5-10X104/ml往往不知从何处着 手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。以一般细胞培养常用的25cm2为例,1）细胞密度在长到约80%90%（下图所示为 80%90%密度时细胞的 大致状态），消化离心收集后，将上清去掉，加入3ml培养基 使其混匀。2）另取一支新的15ml无菌离心管（

7、为下一步接种96孔板用），装入 约 9ml 培养基.3）从第一步准备的 3ml 细胞悬液中取 1ml, 加入上管，混匀后细胞 计数，此时一般为或小于5-10X104/ml,该浓度相当于细胞计 数板 4 个大格内每大格平均5-10个细胞（见下图）；如果不够 该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。4）细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以（相当于细胞悬液密度为2X104/ml）,细胞毒性实验每孔500010000个（相当于细胞悬液密度为5X104/ml）。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。

8、2. 将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul,这样待测细 胞的密度为500010000/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因 此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6 个孔就混匀一 次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于 MTT 的结果至关重要。 3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96 孔平底板） , 加入浓度梯度的药物, 原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药. 一般 5-7 个梯度, 每孔 100ul, 设 3-5 个复孔. 建议设6 个，否则难以反应真实情况。下

9、图可做为 96 孔板的的参考步局。对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔 板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的 药物配好，然后将 96 孔板中的培养上清去掉（可以用排枪吸走）再 加入 100ul 含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。 另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96 孔板的培养液全部 吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于 96 孔板干燥 引起细胞死亡。4. 5%C02, 37C孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。5. 每孔加入 10U1MTT 溶液（5mg/ml，即 0

10、.5%MTT）,继 续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心 用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。6. 终止培养，准备溶解结晶。溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解1）MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。 将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤 纸在桌面，然后将 96 孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都 有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用 哪种方法，可以自己摸索一下再决定。2）每孔加入 150ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10m

11、in，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔 的吸光值。另一种方法，用三联溶解液（见上面 MTT甲瓒溶解液）1）MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul 溶解液。（该溶解液因含有 SDS ，在低温保存的 时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室 温，将SDS结晶全部溶解后再使用。）2）放入培养箱中继续孵育 46小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37C孵育 4 小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。在实际的操作过程中，往

12、往为了等待 46 小时，使得 实验者在下班以后或者晚上来测 OD 值，给实验者带来 了很大的不方便。个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再 测对 OD 值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不 过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放 入培养箱中，第二天上班时再测OD值就可以了。7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、 相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。六、& QMTT结果分析关于如何计算 IC501、改良寇式法：lgIC50二Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4）Xm:lg 最大剂量I：lg（最大剂量/相临剂量）P： 阳性反应率之和Pm： 最大阳

13、性反应率Pn： 最小阳性反应率举个例子：各药物浓度作用于某肿瘤细胞后所得MTT值如下公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率 抑制率=1-加药组 OD 值 /对照组OD值，如对于100ug/ml的药物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各组抑制率如下：药物浓度ug/ml100502512.5MTT 所有问题大汇总Q越实验前应明确的问题1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下， 96 孔培养板的一内贴壁细 胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此， 在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接 种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每

14、孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与 细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。2. 药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大 的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！ 否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得 到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得 平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时 候的细胞增殖抑制表现的最明显）。4. 培养时间。 200ul

15、 的培养液对于 10 的 45 次方的增殖期细胞来说，很难维持68h,如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋 于静止，影响结果，我们是在 48h 换液的。5. MTT 法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。6. 理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。7. 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二 甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜， 不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。8. 避免血清干扰。用含 15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质 会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此， 一般选小于 10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内 残余培养液。实验步骤贴壁细胞：1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测 细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。2. 5%C02, 37C孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间， 但我们常在前一天下