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1、一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH ）是两个分子脲经180C左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO形成紫色络合物，称为双缩脲反应4 凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键， 这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无 关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为110mg蛋白质。干扰这一测定的物 质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主 要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精
2、确的蛋 白质测定。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制 成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度lmg/ml的A280为0.66来校正其纯 度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出 其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用HO或20.9%NaCl 配制，酪蛋白用 005N NaOH 配制。（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO5也0）和6.0克酒石酸钾钠（KNaCHO4H 0），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，4 4 62用水稀释
3、到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保 存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。2. 器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。（三）操作方法1标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8， 1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。 充分摇匀后，在室温（2025C ）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用 未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质 的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定：取23个试管，用上述同样的方法，测定未知样品
4、的蛋白质浓 度。注意样品浓度不要超过 10mg/ml。三、Folin一酚试剂法（Lowry法）一）实验原理 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由 于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所 取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色 反应产生深兰色的原因是:在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合 物。Folin酚试剂中的磷钼酸盐一磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残 基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深
5、度与蛋 白的量成正比。Folin一酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物 化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多， 缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且 专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰 Lowry 反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、 甘氨酸、糖类、甘迪等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳Q%）, 硝酸纳（1%）,三氯乙酸（0.5%）,乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等 溶液对显色无影响，但这些物质浓度高
6、时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液， 只须加浓碳酸钠一氢氧化钠溶液,即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色 浅，则必须提高碳酸钠一氢氧化钠溶液的浓度12倍。进行测定时，加Folin酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下 稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin 酚试剂加到碱性 的铜一蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸一磷钨酸试剂被破坏之前， 还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20250mg。（二）试剂与器材1. 试剂（1）试剂甲：（A）10克N%, 2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠
7、（KNaH 064也0）。溶解于500毫升蒸馏水中。4 42（B）0.5克硫酸铜（CuSO5H 0）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将5042份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na W042H 0） ,25克钼酸钠2 2（Na MoO42H 0）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，2 2 充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂 （Li2S0），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过 4量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀
8、释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作 指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。（ 3）标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或g球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。 牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。2. 器材（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取16支大试管， 1 支作空白， 3支留作未知样品，其余试管 分成两组，分别加入0， 0.1， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1. 0毫升标准蛋白质溶液（浓 度为250mg/ml）。
9、用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在 旋涡混合器上迅速混合，于室温（2025C ）放置10分钟。再逐管加入0.5毫 升试剂乙（Folin酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使 显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作 为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标， 吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。注意：因 Lowry 反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间， 即第1 支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时， 1 分钟后，第2支试管加入5毫 升试剂甲， 2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管
10、加完试剂甲后若已超过 10分钟，则第1 支试管可立即加入0.5毫升试剂乙， 1分钟后第2支试管加入 0.5毫升试剂乙， 2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂 后，再放置 30 分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下 面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺 序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光 度值。2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20250微克），按上述方 法进行操作，取1 毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标 准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3 个试管。如上表中的 8、9、10 试管。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品 溶液的蛋白质浓度。注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同 的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标 准蛋白质）。
