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1、应用DNA微阵列技术研究三氧化二砷对RPMI 8226细胞的作用王梦昌，刘陕西，刘蓬勃【关键词】三氧化二砷摘要目的：应用DNA芯片技术研究三氧化二砷对多发性骨髓瘤细胞株RPI8226的作用。方法：采用包含4096个人类基因的DNA表达谱芯片，检测三氧化二砷作用于RPI8226细胞24h前后其基因表达的变化。结果：在RNA程度上，273个基因的表达发生了明显改变，其中121个基因表达上调，152个基因表达下调。结论：三氧化二砷可引起RPI8226细胞株一系列基因表达的改变。ZFYVE16、TXNIP及ALK1基因可能与RPI8226细胞的分化与凋亡亲密相关。关键词三氧化二砷;DNA微阵列;多发性
2、骨髓瘤hangesfgeneexpressinprfilefultipleyelaelllineRPI8226treatedbyarsenitrixideABSTRATbjetive:TparethehangesfgeneexpressinprfilesfultipleyelaelllineRPI8226befreandafter24hurinterventinfarsenitrixide.ethds:TherespnsesftheRPI8226ellstarsenitrixideeredeterinedithDNAirarrayhihinluded4096differenthuangenes
3、.Results:fthese4096genes,theexpressinsf273geneserealteredsignifiantlyatRNAlevel.Theexpressinsf121genesereupregulatedhiletheexpressinsf152geneserednregulated.nlusin:TheeffetfarsenitrixidenRPI8226ellsisrelatedthangingtheexpressinlevelsfanuberfgenes.ZFYVE16,ALK1andTXNIPgenesayplayiprtantrlesinapptsisan
4、ddifferentiatinfRPI8226ells.KEYRDSarsenitrixide;DNAirarray;ultipleyela多发性骨髓瘤ultipleyela,是一种浆细胞恶性增殖性疾玻由于瘤细胞的增殖比例很低及多药耐药的形成，目前临床治疗该病仍非常困难，迄今为止尚无根治的方法。最近的临床资料显示，三氧化二砷对有一定的治疗效果，且无严重的毒副作用1,2。为探寻三氧化二砷治疗的作用机制，本实验应用DNA微阵列技术研究三氧化二砷作用于细胞株后对其基因网络的调控作用。1材料与方法1.1材料1三氧化二砷，购自中国药品公司，样品溶于RPI1640培养基美国Gib公司产品，灭菌分装备用，存
5、储浓度为35g/L，使用时稀释为工作浓度2l/L。2RPI8226细胞，为人类细胞株，由西安交通大学第一医院血液中心提供。1.2细胞培养取RPI8226细胞按1105/l浓度分别接种于含及不含2l/L三氧化二砷的新颖RPI1640培养基中内含10%小牛血清、1l/L谷氨酰胺、1l/L丙酮酸、100U/l青霉素、100U/l链霉素，于37、5%2培养箱中培养24h后搜集细胞。1.3总RNA的提取按照TRIzlReagent美国Gib公司产品说明书进展操作，提取RPI8226细胞总RNA，采用ligtexRNAidiKit荷兰QIAGEN公司产品纯化RNA，应用RNA电泳及分光光度仪测定光密度pt
6、idensity,D值，计算D260/D280值以鉴定RNA质量。1.4探针标记按美国Bistar公司芯片杂交试剂盒说明书操作。分别等量混合未使用三氧化二砷干预的RPI8226细胞总RNA及已使用三氧化二砷干预24h后的RPI8226细胞总RNA，各提取50g逆转录合成DNA。采用荧光染料y3dTP标记未使用三氧化二砷干预的RPI8226细胞DNA，y5dTP标记已使用三氧化二砷干预24h后的RPI8226细胞DNA，S200纯化柱纯化DNA。1.5DNA微阵列制备DNA微阵列包含4096个基因DNA上海博星基因芯片提供，型号BistarH40s，包括癌基因、抑癌基因、细胞信号转导基因、凋亡相
7、关基因及阴性对照等。采用通用引物进展多聚酶链反响plyerasehainreatin,PR扩增。使用美国artesian公司的artesian点样仪及美国Telehe公司的硅烷化玻片进展点样。玻片经水合、枯燥、紫外线交联后，分别采用2g/L十二烷基硫酸钠sdiuddeylsulfate,SDS、水和2g/L硼氢化钠溶液处理10in，晾干备用。1.6杂交及洗涤DNA微阵列在95水浴中变性2in，混合探针在95水浴中变性30s，将混合探针加于DNA微阵列上，42杂交1618h，按顺序使用2氯化钠/柠檬酸钠sdiuhlride/sdiuitrate,SS缓冲液加2g/LSDS、0.1SS加2g/LS
8、DS、0.1SS洗涤10in后，室温晾干。1.7基因表达谱检测与分析采用SanArray4000扫描仪美国GeneralSanning公司产品扫描DNA微阵列，GenePixPr3.0软件分析y3和y5这两种荧光信号的强度和比值。经两种波长扫描获得的强度值分别代表y3和y5的数值，计算每个点y3/y5的比值。2结果2.1DNA微阵列的质量标准控制BistarH40s表达谱DNA微阵列的质量标准：有96个管家基因阳性对照和20个内参基因必须为阳性，16个植物基因阴性对照和16个点样液空白对照必须为阴性。本实验结果完全符合上述条件，说明实验无污染且检测体系正常。2.2差异表达基因先将所有数据的前景
9、值与背景值相减，得出y3、y5标记的强度值，将所有200的强度值用200取代。根据总数为n的有效基因selet值1，y3、y5标记的强度值皆200，或者其中1项800y5/y3比值的自然对数值InRiIny5/y3，以Ri值在0.110的有效基因作为均一化根据，计算这些基因y5/y3比值自然对数的平均值，即均一化nralizatin系数。将所有数据项的y3标记强度值乘均一化系数，得出调整后的y3。计算所有基因y5/y3的比值，列出比值2或0.5的数据，从中挑选出具有一样GeneID的数据，在与两种探针杂交时皆表现出一定的差异，且上下调趋势一致。根据以上挑选标准，RPI8226细胞在三氧化二砷处
10、理前后y5/y3的比值2或0.5，且同一基因两个重复点表达均有一样变化的共有273个，其中表达上调的基因有121个，表达下调的基因有152个。见表1、2，图1、2。表1三氧化二砷干预后RPI8226表达上调基因略Table1UpregulatedgenesinRPI8226ellsaplesafterarsenitrixideinterventin表2三氧化二砷干预后RPI8226表达下调基因略Table2DnregulatedgenesinRPI8226ellsaplesafterarsenitrixideinterventin图1y5、y3荧光标记三氧化二砷干预和未干预RPI8226细胞样
11、品叠加图略Figure1Superpsitinapsfy5andy3labeledRPI8226ellsaplestreatedithandithutarsenitrixidennespt,ify3signalasuhstrngerthany5signal,itshedgreen(i.e.dnregulatin);ify5signalasuhstrngerthany3signal,itshedred(i.e.upregulatin);iftheintensitiesfy3andy5signalseresiilar,itshedyell.图2三氧化二砷干预与未干预RPI8226细胞样品y5/y3
12、比值散点图略Figure2Satterdiagrafy5/y3ratisinRPI8226ellsaplestreatedithandithutarsenitrixideXaxisandYaxisrepresentedtheflureseneintensitiesfy3andy5respetively.EahpintinthesatterdiagrarepresentedthehybridizatinsignalfrrespndinggeneinDNAirarray.Theredpinteantthatthey5/y3ratiasithintherangef0.5t2.0(ithnsignif
13、iantdiffereneingeneexpressin).Theyellpinteantthatthey5/y3ratiasbeyndtherangef0.5t2.0(ithsignifiantdiffereneingeneexpressin).3讨论本研究应用DNA表达谱芯片技术检测三氧化二砷未干预及干预24h后RPI8226细胞的基因表达差异，探寻三氧化二砷治疗的机制。实验结果显示，在4096个基因中差异表达基因273个，其中上调基因121个，下调基因152个，这些基因的功能涉及细胞生命活动的各个方面，如信号转导、蛋白质合成、免疫、代谢、DNA合成及细胞周期等，其中有些基因的功能不详。由
14、于基因的表达受网络式调控，各个基因之间的表达是互相影响的，因此三氧化二砷干预后各基因的表达既有上调，又有下调。B细胞易位基因1Belltranslatingene1,BTG1是p53的上调基因，属于抗增殖基因，主要调节细胞增殖和分化3。此基因首先在B细胞慢性淋巴细胞白血病中被发现，其RNA长度1.8kb。有实验说明，BTG1蛋白通过与HXB9hebxprtEinHxB9及蛋白质精氨酸N甲基转移酶1prteinarginineethyltransferase1,PRT1结合，调节其转录活性4,5和血管增殖6，从而抑制肿瘤细胞的增殖。BTG1蛋白可被无所不在的蛋白酶系统降解，该降解过程又可被特定的
15、蛋白酶抑制剂所终止。本研究结果显示，三氧化二砷干预RPI8226细胞24h后，其BTG1的表达明显上调，推测可能与三氧化二砷抑制相关蛋白酶有关，提示BTG1在RPI8226细胞凋亡及分化过程中起重要作用。ZFYVE16基因位于染色体5p15.2q14.3，编码endfin蛋白质，此蛋白质广泛存在于细胞的早期核内体，通过其FYVE功能区与核内体相联络，调节细胞膜的物质交换7。Endfin的过度表达可引起核内体网格蛋白lathrin增多，导致高频率的核内体交融，这种作用是经由T1基因实现的8,9。三氧化二砷干预24h后，RPI8226细胞ZFYVE16基因上调，是否由于这种基因的上调导致了RPI8226细胞的凋亡，至今仍不清楚；另一个上调的基因是TP53BP1，编码53BP1，可与野生型p53结合以诱导p53依赖蛋白的表达，在信号转导中进步p53的活性10。本实验中，多个与信号转导相关基因的表达下调。如活化素受体样激酶ativinreeptrlikekinase1,ALK1基因是转化生长因子transfringgrthfatr,TGF受体家族成员，主要表达于内皮细胞，诱导Sad1/5磷酸化而使内皮细胞发生增殖和迁移11，促进肿瘤生长。肿瘤血管生成时，ALK1表达增高。本研究结果显示，三氧化二砷干预24h后
