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1、张剋工哎大毕业设计（论文）任务设计（论文）题目 瓜蒌多糖提取、纯化、分子修饰及其工艺设计学院名称 专业（班级） 姓名（学号） 指导教师生物与食品工程学院生物工程（09-2班）陈红磊（20096098）李军红系（教研室）负责人 叶明一、毕业设计（论文）的主要内容及要求（任务及背景、工具环境、成果形式、着重培养的能力（一）毕业设计（论文）的主要内容1瓜蒌多糖的分离纯化。2对纯化后的多糖进行分子修饰。3研究多糖修饰前后对a-葡萄糖酶活性的影响。4瓜蒌多糖的提取及工艺设计。（二）毕业设计（论文）的基本要求1. 根据论文题目，阅读相关文献，全面了解植物多糖提取纯化，分子修饰及其修饰前后对降血糖活 性的知
2、识；2. 通过阅读相关文献，设计实验方案；3. 综合相关文献写出毕业论文前言，包括国内外研究现状及现实意义、研究目的以及对所研究问题 的认识及其中心论点；4掌握多糖提取、分离纯化工艺、分子修饰工艺及活性研究知识等。5. 按毕业设论文格式书撰写1.5-2.0万字论文，其中中文摘要约300字，英文摘要约250个实词；翻 译1-2万字符（或译出5000汉字）与本课题有关的央文文献（并附原文）；6. 撰写一篇研究论文。二、应收集的资料及主要参考文献1. Carbohydrate polysaccharideJournal2. Food ChemistryJournal3生物技术期刊，4. 生物工程学报
3、期刊5. Qilin Huang, Lina Zhang.Preparation. chain conformation and anti-tumor activities ofwater-soluble phosphated (l3)-d-glucan from Poria cocos mycelia.Carbohydrate PolymersJ. 83 (2011): 1363-1369.论文三、毕业设计（论文）进度计划起迄日期工作 内容备注2012.12.242013.3.152013.3.16 2013.3.222013.3.232013.4.232013.4.242013.5.720
4、13.5.8 2013.5.152013.5.16 2013.6.162013.6.17 2013.6.23查阅资料，毕业实习，外文翻译，完成开题报 告；预备试验，开题；瓜蒌多糖提取及纯化；对多糖进行甲基化等修饰；多糖修饰前后对a-葡萄糖酶活性影响的研究； 瓜蒌多糖提取工艺设计资料整理，数据分析，论文撰写，答辩准备； 答辩、评定成绩。在实验的同时完成 央文翻译、论文前 言；在实验的同时要 做到论文的撰写与 实验同步。开题报告(该表格由学生独立完成)一. 毕业设计(论文)题目瓜蒌多糖提取、纯化、分子修饰及其工艺设计二. 课题来源、目的、意义及该课题在国内外的概况：课题来源：瓜蒌深加工关键技术研发
5、及产业化，企业委托项目。目的意义：栝楼属(Trichosanthes Linn.)是葫芦科中一个比较大的属,共有80多种植物，大多为雌雄 异株,其分布地区为东亚及澳大利亚北部，其中我国有一半的种类。栝楼属植物的化学成分主要有油 脂、有机酸类、黄酮类、三萜、甾体类、甾醇及蛋白质等。本属有多种药用植物其药用价值很高;具 有润肺止咳、清热化痰之功效,主治咳嗽痰多、胸痹肋痛、大便燥结等症，其中天花粉蛋白在临床上 用来引产。研究表明瓜蒌皮提取物能明显降低小鼠的血糖和血脂，对人脐带静脉内皮细胞的损伤具有 保护作用。而瓜蒌皮中含有很多多糖类物质，瓜蒌多糖属于植物多糖类。因此推测瓜蒌多糖具有降血 糖、降血脂的
6、功能。但瓜蒌活性多糖的一级结构如何？其构效关系如何？目前尚不十分清楚。因此制约了药用瓜蒌的 开发与利用。因此为了阐述瓜蒌多糖活性机理、深入研究瓜蒌多糖，欲对瓜蒌多糖的产量、分级分离、 单一组分的理化性质、化学结构进行研究，进一步研究该多糖的降血脂及肝肾损伤修复活性。瓜蒌多 糖作为一类重要的生物活性物质，虽然到目前为止还未应用于临床，但其多方面的生物学功能，使多 糖药物及保健品具有很广阔的应用前景。因此对瓜蒌多糖进行深入研究具有十分重要的意义和开发应 用价值。国内外概况：栝楼属(Trichosanthes Linn.)是葫芦科中一个比较大的属，共有80多种植物，大多为雌雄 异株,其分布地区为东亚
7、及澳大利亚北部，其中我国有一半的种类。长期以来，国际学者对瓜蒌提取 物进行过不少研究，最近的研究结果表明，瓜蒌皮提取物，具有降血糖、降血脂、抗肿瘤的功能。瓜蒌果皮含有苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等种必需氨基 酸及丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸、门冬氨酸等 10种非必需氨基酸1无机元素分析结果表明，栝楼果皮中含有丰富的钾、钙、镁、铁、锌、铜、锰、钠、钻、镍、锶 等元素。巢志茂等研究发现，栝楼果实中的钙、镁含量较高，铜、锌、锰等元素含量亦较其他果 实为高，但铁含量较低，且同一元素在种子和果皮中的分布有差别。瓜蒌富含蛋白质、油脂
8、、挥发油、甾醇、三萜、无机元素等化学成分，但对瓜蒌多糖成分的研究 尚未见报导。越来越多的研究发现，多糖对人体具有极大的利用价值，许多中药所含多糖均有显著的药 用功效，如免疫增强作用，降血糖作用，抗氧化作用等。程俊文等发现灵芝多糖提取物胶囊具有较强的免疫调节作用；韦璐等验证了金花茶多糖具有明 显的降血脂功能6；李红等人研究发现车前子粗多糖具有治疗便秘的功效7；童红莉等人研究发现， 黄芪多糖具有降低高血脂大鼠的功能。因此分析瓜蒌皮多糖的活性，研制瓜蒌皮多糖胶囊，为瓜蒌多 糖的进一步研究利用提供了一定的基础。屠婕红等从瓜蒌中提取多糖，纯化，并分析其单糖组成，发现瓜蒌多糖由三种单糖组成，分别是 鼠李糖
9、、阿拉伯糖和葡糖糖。但瓜蒌活性多糖的一级结构如何？其构效关系如何？目前国内外学者尚 未解析清楚。近年来，植物多糖的研究逐步活跃起来，其中，一些分子量在几千以上，具有很强生物活性的活 性多糖的研究受到日益重视，它们的生理功能、化学结构以及构效关系等正成为多糖研究的前沿阵地， 取得了很大进展，而关于多糖分离、纯化和结构测定的方法也不断发展和完善。但多糖作为一种重要 的生物活性物质，还有很大的发展空间，寻找新的具有生物活性的糖类，建立糖种类和功能数据库， 筛选糖类的模拟物，探索更为有效的结构测定方法，总结糖复合物的构效关系，研究糖基化的调控机 制，进而对天然糖链进行修饰和人工合成，改造已有的药物，开
10、发多糖药物，使用糖类导向和定位药 物，使用糖类提高药物在体内的寿命等等，均能为多糖的开发提供理论指导和实践基础。三. 尚待研究问题：1、瓜蒌多糖提取条件的优化；2、瓜蒌多糖的分离纯化；3、瓜蒌多糖磷酸化分子修饰；4、瓜蒌多糖修饰前后多a葡萄糖苷酶活性的比较研究；4、瓜蒌多糖生产车间的设计。四. 可能的思路或方案1. 瓜蒌多糖的超声波辅助提取工艺优化1-411提取时间对多糖提取率的影响选择最适超声波温度，固定液料比为30:1,每管中加入O.lg瓜蒌皮粉末,分别以提取不同时间（10, 15, 20, 25, 30 min）进行超声波辅助提取，设定超声波提取器的提取功率为80%。提取液过滤，上清 液
11、加入4倍95%的乙醇沉淀，离心，沉淀复溶，苯酚-硫酸法测多糖含量，并计算多糖得率。1.2液料比对多糖提取率的影响选择最佳微波温度和提取时间，每管中加入0.1g瓜蒌皮粉末，分别以不同的液料比（20:1、30:1、 40:1、50:1、60:1）加入自来水进行微波辅助提取，设定超声波提取器的提取功率为80%，提取后统一 补水到10 ml,提取液过滤，上清液加入4倍95%的乙醇沉淀，离心，沉淀复溶，用苯酚-硫酸法进行 显色，测定多糖的吸光度，并计算多糖的得率。1.3功率对多糖提取率的影响选择最佳微波温度、提取时间和液料比，每管中加入0.1g瓜蒌皮粉末，分别以不同的功率（60%、 70%、80%、90
12、%、100%）加入自来水进行微波辅助提取。提取液过滤，上清液加入4倍95%的乙醇 沉淀，离心，沉淀复溶，用苯酚-硫酸法进行显色，测定多糖的吸光度，并计算多糖的得率。1.4响应面试验根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，选取超声温度、时间、料液比3个因素为自变量， 以单因素试验得出的各最佳条件为中心点，以瓜蒌多糖含量为响应值，利用超声波辅助技术对瓜蒌多 糖提取条件进行优化试验，采用design expert软件进行响应面试验设计优化提取多糖的工艺参数，确 定最佳试验方案。超声温度、时间、料液比，分别以x1，x2, x3表示，按方程Xi=（xi-x0）/x对自变量进行编码（Xi 为自
13、变量的编码值，x.为自变量的真实值，x0为试验中心点处自变量的真实值，Ax为自变量的变化 i0步长），并以自变量的编码值+1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平，以生物量Y为相应值。响 应面试验因素水平表见表1。表1 Box-Behnken设计试验因素水平及编码表水平因素编码值 -1 0 1温度/CX1506070时间 /minX2152025料液比X31:301:401:501.5统计分析采用DPS软件处理系统进行直观分析、回归分析，建立回归方程并进行显著性分析。16验证试验以均匀试验回归分析和直观分析所得较优发酵条件、基础发酵条件进行试验，各平行三组。2. 多糖的提取、分离、纯化：2.
14、1多糖提取提取条件：料液比1:15,温度60C，时间30min,功率60%。将粉碎后的瓜蒌皮置于1000mL烧杯中，在60C超声30min后得到瓜蒌多糖粗提液，粗体液经抽 滤、浓缩后加入4倍体积的95%乙醇，于4C沉淀24h。然后4500 rmin-1离心20 min，除去上清液， 沉淀用蒸馏水溶解并冷冻干燥即得胞外粗多糖。22、多糖分离纯化（1）脱蛋白：取瓜蒌多糖溶液50 mL加入1/3体积的Sevage试剂（氯仿、正丁醇体积比4:1）， 将混合物剧烈振摇20 min，再静止20 min。用分液漏斗分液，分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白， 重复至水相与溶剂相的交界面无胶状变性蛋白质。（2）脱
15、色：脱蛋白后，向多糖溶解液中加入其体积10%的30%的H2O2, 50 C保温脱色后，得到 胞外粗多糖溶液。（3）透析袋透析：将脱蛋白后的多糖水溶液置于透析袋（直径25mm、截留分子量3500Da）中， 自来水逆向流动透析48h，再用蒸馏水透析24h。3. 瓜蒌多糖的磷酸化修饰及其对a -葡萄糖苷酶活性的影响3.1瓜蒌多糖的磷酸化修饰10-12】小烧杯中用100ml水溶解一定量的浓度为0.1g/ml的磷酸化试剂（三聚磷酸钠与三偏磷酸钠质量 比为6:1）和5%的Na2SO4（减少反应时的起泡现象），溶解后再加入精制的0.01g/mL的瓜蒌多糖，用 NaHCO3调pH =9后，在80C条件下反应5h,样液用3倍体积的95%乙醇沉淀24h,将醇沉多糖冷冻 干燥，再于60C水浴中复溶，复溶后的溶液于透析袋（截留相对分子质量为10000）以蒸馏水为透析 液透析24h,将透析袋内液体浓缩到适量体积后进行冷冻干燥得磷酸化衍生物。3.2磷酸根的测定（钼蓝比色法）13磷酸二氢钾标准液的制备：准确称取1g KH2PO4溶于1000ml蒸馏水中，吸取10ml上述溶液，蒸 馏水稀释至1000ml,摇匀后备用，此溶液浓
