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1、张剋工哎大毕业设计(论文)任务设计(论文)题目 瓜蒌多糖提取、纯化、分子修饰及其工艺设计学院名称 专业(班级) 姓名(学号) 指导教师生物与食品工程学院生物工程(09-2班)陈红磊(20096098)李军红系(教研室)负责人 叶明一、毕业设计(论文)的主要内容及要求(任务及背景、工具环境、成果形式、着重培养的能力(一)毕业设计(论文)的主要内容1瓜蒌多糖的分离纯化。2对纯化后的多糖进行分子修饰。3研究多糖修饰前后对a-葡萄糖酶活性的影响。4瓜蒌多糖的提取及工艺设计。(二)毕业设计(论文)的基本要求1. 根据论文题目,阅读相关文献,全面了解植物多糖提取纯化,分子修饰及其修饰前后对降血糖活 性的知
2、识;2. 通过阅读相关文献,设计实验方案;3. 综合相关文献写出毕业论文前言,包括国内外研究现状及现实意义、研究目的以及对所研究问题 的认识及其中心论点;4掌握多糖提取、分离纯化工艺、分子修饰工艺及活性研究知识等。5. 按毕业设论文格式书撰写1.5-2.0万字论文,其中中文摘要约300字,英文摘要约250个实词;翻 译1-2万字符(或译出5000汉字)与本课题有关的央文文献(并附原文);6. 撰写一篇研究论文。二、应收集的资料及主要参考文献1. Carbohydrate polysaccharideJournal2. Food ChemistryJournal3生物技术期刊,4. 生物工程学报
3、期刊5. Qilin Huang, Lina Zhang.Preparation. chain conformation and anti-tumor activities ofwater-soluble phosphated (l3)-d-glucan from Poria cocos mycelia.Carbohydrate PolymersJ. 83 (2011): 1363-1369.论文三、毕业设计(论文)进度计划起迄日期工作 内容备注2012.12.242013.3.152013.3.16 2013.3.222013.3.232013.4.232013.4.242013.5.720
4、13.5.8 2013.5.152013.5.16 2013.6.162013.6.17 2013.6.23查阅资料,毕业实习,外文翻译,完成开题报 告;预备试验,开题;瓜蒌多糖提取及纯化;对多糖进行甲基化等修饰;多糖修饰前后对a-葡萄糖酶活性影响的研究; 瓜蒌多糖提取工艺设计资料整理,数据分析,论文撰写,答辩准备; 答辩、评定成绩。在实验的同时完成 央文翻译、论文前 言;在实验的同时要 做到论文的撰写与 实验同步。开题报告(该表格由学生独立完成)一. 毕业设计(论文)题目瓜蒌多糖提取、纯化、分子修饰及其工艺设计二. 课题来源、目的、意义及该课题在国内外的概况:课题来源:瓜蒌深加工关键技术研发
5、及产业化,企业委托项目。目的意义:栝楼属(Trichosanthes Linn.)是葫芦科中一个比较大的属,共有80多种植物,大多为雌雄 异株,其分布地区为东亚及澳大利亚北部,其中我国有一半的种类。栝楼属植物的化学成分主要有油 脂、有机酸类、黄酮类、三萜、甾体类、甾醇及蛋白质等。本属有多种药用植物其药用价值很高;具 有润肺止咳、清热化痰之功效,主治咳嗽痰多、胸痹肋痛、大便燥结等症,其中天花粉蛋白在临床上 用来引产。研究表明瓜蒌皮提取物能明显降低小鼠的血糖和血脂,对人脐带静脉内皮细胞的损伤具有 保护作用。而瓜蒌皮中含有很多多糖类物质,瓜蒌多糖属于植物多糖类。因此推测瓜蒌多糖具有降血 糖、降血脂的
6、功能。但瓜蒌活性多糖的一级结构如何?其构效关系如何?目前尚不十分清楚。因此制约了药用瓜蒌的 开发与利用。因此为了阐述瓜蒌多糖活性机理、深入研究瓜蒌多糖,欲对瓜蒌多糖的产量、分级分离、 单一组分的理化性质、化学结构进行研究,进一步研究该多糖的降血脂及肝肾损伤修复活性。瓜蒌多 糖作为一类重要的生物活性物质,虽然到目前为止还未应用于临床,但其多方面的生物学功能,使多 糖药物及保健品具有很广阔的应用前景。因此对瓜蒌多糖进行深入研究具有十分重要的意义和开发应 用价值。国内外概况:栝楼属(Trichosanthes Linn.)是葫芦科中一个比较大的属,共有80多种植物,大多为雌雄 异株,其分布地区为东亚
7、及澳大利亚北部,其中我国有一半的种类。长期以来,国际学者对瓜蒌提取 物进行过不少研究,最近的研究结果表明,瓜蒌皮提取物,具有降血糖、降血脂、抗肿瘤的功能。瓜蒌果皮含有苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等种必需氨基 酸及丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸、门冬氨酸等 10种非必需氨基酸1无机元素分析结果表明,栝楼果皮中含有丰富的钾、钙、镁、铁、锌、铜、锰、钠、钻、镍、锶 等元素。巢志茂等研究发现,栝楼果实中的钙、镁含量较高,铜、锌、锰等元素含量亦较其他果 实为高,但铁含量较低,且同一元素在种子和果皮中的分布有差别。瓜蒌富含蛋白质、油脂
8、、挥发油、甾醇、三萜、无机元素等化学成分,但对瓜蒌多糖成分的研究 尚未见报导。越来越多的研究发现,多糖对人体具有极大的利用价值,许多中药所含多糖均有显著的药 用功效,如免疫增强作用,降血糖作用,抗氧化作用等。程俊文等发现灵芝多糖提取物胶囊具有较强的免疫调节作用;韦璐等验证了金花茶多糖具有明 显的降血脂功能6;李红等人研究发现车前子粗多糖具有治疗便秘的功效7;童红莉等人研究发现, 黄芪多糖具有降低高血脂大鼠的功能。因此分析瓜蒌皮多糖的活性,研制瓜蒌皮多糖胶囊,为瓜蒌多 糖的进一步研究利用提供了一定的基础。屠婕红等从瓜蒌中提取多糖,纯化,并分析其单糖组成,发现瓜蒌多糖由三种单糖组成,分别是 鼠李糖
9、、阿拉伯糖和葡糖糖。但瓜蒌活性多糖的一级结构如何?其构效关系如何?目前国内外学者尚 未解析清楚。近年来,植物多糖的研究逐步活跃起来,其中,一些分子量在几千以上,具有很强生物活性的活 性多糖的研究受到日益重视,它们的生理功能、化学结构以及构效关系等正成为多糖研究的前沿阵地, 取得了很大进展,而关于多糖分离、纯化和结构测定的方法也不断发展和完善。但多糖作为一种重要 的生物活性物质,还有很大的发展空间,寻找新的具有生物活性的糖类,建立糖种类和功能数据库, 筛选糖类的模拟物,探索更为有效的结构测定方法,总结糖复合物的构效关系,研究糖基化的调控机 制,进而对天然糖链进行修饰和人工合成,改造已有的药物,开
10、发多糖药物,使用糖类导向和定位药 物,使用糖类提高药物在体内的寿命等等,均能为多糖的开发提供理论指导和实践基础。三. 尚待研究问题:1、瓜蒌多糖提取条件的优化;2、瓜蒌多糖的分离纯化;3、瓜蒌多糖磷酸化分子修饰;4、瓜蒌多糖修饰前后多a葡萄糖苷酶活性的比较研究;4、瓜蒌多糖生产车间的设计。四. 可能的思路或方案1. 瓜蒌多糖的超声波辅助提取工艺优化1-411提取时间对多糖提取率的影响选择最适超声波温度,固定液料比为30:1,每管中加入O.lg瓜蒌皮粉末,分别以提取不同时间(10, 15, 20, 25, 30 min)进行超声波辅助提取,设定超声波提取器的提取功率为80%。提取液过滤,上清 液
11、加入4倍95%的乙醇沉淀,离心,沉淀复溶,苯酚-硫酸法测多糖含量,并计算多糖得率。1.2液料比对多糖提取率的影响选择最佳微波温度和提取时间,每管中加入0.1g瓜蒌皮粉末,分别以不同的液料比(20:1、30:1、 40:1、50:1、60:1)加入自来水进行微波辅助提取,设定超声波提取器的提取功率为80%,提取后统一 补水到10 ml,提取液过滤,上清液加入4倍95%的乙醇沉淀,离心,沉淀复溶,用苯酚-硫酸法进行 显色,测定多糖的吸光度,并计算多糖的得率。1.3功率对多糖提取率的影响选择最佳微波温度、提取时间和液料比,每管中加入0.1g瓜蒌皮粉末,分别以不同的功率(60%、 70%、80%、90
12、%、100%)加入自来水进行微波辅助提取。提取液过滤,上清液加入4倍95%的乙醇 沉淀,离心,沉淀复溶,用苯酚-硫酸法进行显色,测定多糖的吸光度,并计算多糖的得率。1.4响应面试验根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理,选取超声温度、时间、料液比3个因素为自变量, 以单因素试验得出的各最佳条件为中心点,以瓜蒌多糖含量为响应值,利用超声波辅助技术对瓜蒌多 糖提取条件进行优化试验,采用design expert软件进行响应面试验设计优化提取多糖的工艺参数,确 定最佳试验方案。超声温度、时间、料液比,分别以x1,x2, x3表示,按方程Xi=(xi-x0)/x对自变量进行编码(Xi 为自
13、变量的编码值,x.为自变量的真实值,x0为试验中心点处自变量的真实值,Ax为自变量的变化 i0步长),并以自变量的编码值+1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平,以生物量Y为相应值。响 应面试验因素水平表见表1。表1 Box-Behnken设计试验因素水平及编码表水平因素编码值 -1 0 1温度/CX1506070时间 /minX2152025料液比X31:301:401:501.5统计分析采用DPS软件处理系统进行直观分析、回归分析,建立回归方程并进行显著性分析。16验证试验以均匀试验回归分析和直观分析所得较优发酵条件、基础发酵条件进行试验,各平行三组。2. 多糖的提取、分离、纯化:2.
14、1多糖提取提取条件:料液比1:15,温度60C,时间30min,功率60%。将粉碎后的瓜蒌皮置于1000mL烧杯中,在60C超声30min后得到瓜蒌多糖粗提液,粗体液经抽 滤、浓缩后加入4倍体积的95%乙醇,于4C沉淀24h。然后4500 rmin-1离心20 min,除去上清液, 沉淀用蒸馏水溶解并冷冻干燥即得胞外粗多糖。22、多糖分离纯化(1)脱蛋白:取瓜蒌多糖溶液50 mL加入1/3体积的Sevage试剂(氯仿、正丁醇体积比4:1), 将混合物剧烈振摇20 min,再静止20 min。用分液漏斗分液,分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白, 重复至水相与溶剂相的交界面无胶状变性蛋白质。(2)脱
15、色:脱蛋白后,向多糖溶解液中加入其体积10%的30%的H2O2, 50 C保温脱色后,得到 胞外粗多糖溶液。(3)透析袋透析:将脱蛋白后的多糖水溶液置于透析袋(直径25mm、截留分子量3500Da)中, 自来水逆向流动透析48h,再用蒸馏水透析24h。3. 瓜蒌多糖的磷酸化修饰及其对a -葡萄糖苷酶活性的影响3.1瓜蒌多糖的磷酸化修饰10-12】小烧杯中用100ml水溶解一定量的浓度为0.1g/ml的磷酸化试剂(三聚磷酸钠与三偏磷酸钠质量 比为6:1)和5%的Na2SO4(减少反应时的起泡现象),溶解后再加入精制的0.01g/mL的瓜蒌多糖,用 NaHCO3调pH =9后,在80C条件下反应5h,样液用3倍体积的95%乙醇沉淀24h,将醇沉多糖冷冻 干燥,再于60C水浴中复溶,复溶后的溶液于透析袋(截留相对分子质量为10000)以蒸馏水为透析 液透析24h,将透析袋内液体浓缩到适量体积后进行冷冻干燥得磷酸化衍生物。3.2磷酸根的测定(钼蓝比色法)13磷酸二氢钾标准液的制备:准确称取1g KH2PO4溶于1000ml蒸馏水中,吸取10ml上述溶液,蒸 馏水稀释至1000ml,摇匀后备用,此溶液浓