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1、T4 DNA Ligase Thermo scientific #EL0011产品信息特点快速 室温下10分钟内完成粘末端的连接反应。 该酶在Fermentas公司限制酶、PCR和RT缓冲液(添加ATP)中活性。 配套提供聚乙二醇溶液以有效进行平末端连接。应用克隆酶切产生的DNA片段。 克隆PCR产物。 连接双链寡聚核苷酸街头或连接物。 定点诱变。 扩增片段长度多态性 (AFLP)。 连接酶介导的 RNA 检测 (3)。 双链DNA，RNA 或 DNA/RNA 复合体中缺口的修复。 线性 DNA自身环化。说明T4 DNA Ligase催化双链DNA或RNA中毗邻的5 -磷酸基团和3-羟基末端之
2、间形成磷酸二酯键。酶还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA复合体中的单链切口，连接DNA的粘性和平末端，但是该酶对单链核酸无酶活性 (1, 2)。T4 DNA Ligase需要辅因子ATP。浓度1 Weiss u/l = 200 CEU*/l5 Weiss u/l = 1000 CEU*/l30 Weiss u/l = 6000 CEU*/l* 一个粘性末端连接单位的是指在16C 、30分钟内50%连接HindIII酶切的lamda DNA产物所需要的酶的量。来源含有T4噬菌体克隆基因30的大肠杆菌。分子量55.3 kDa，单体。活性单位定义1个活性单位是指在ATP-PPi交换反应中，3
3、7C、20分钟内将1nmol 32PPi转换为Norit可吸收形式所需的酶量(Weiss单位*(4)。酶活性分析混合物：66 mM Tris-HCl (pH 7.6), 6.6 mM MgCl2, 0.066 mM ATP, 10 mM DTT, 3.3M 32PPi.* 1个Weiss单位相当于约200个粘性末端连接单位。1个粘性末端连接单位：20 l反应体系(50 mM Tris-HCl(pH7.5), 10 mM燤gCl2, 10 mM燚TT, 1 mM ATP, 25 g/ml燘SA, 0.12 M (300g/ml)的5-DNA末 端)中， 在16C、30分钟内50%连接HindII
4、I酶切的Lambda DNA产物所需要的酶量。保存缓冲液保存缓冲液组分：20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA和50% (v/v)甘油。10X T4 DNA Ligase 缓冲液(#B69)400 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP (pH 7.8, 25C)。质量控制相关测试表明无内切和外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、磷酸酶污染。 功能检测：粘性末端或平末端DNA的连接能力。抑制与失活 抑制剂：当反应体系中NaCl或KCl的浓度超过200 mM时，可强烈抑制
5、T4 DNA Ligase活性。 失活：65C加热10分钟或者70C加热5分钟。备注 聚乙二醇(PEG) 极大地增加平末端连接效率 (5) 。反应体系中的PEG 4000的建议浓度为5% (w/v)。 T4 DNA Ligase与DNA结合会改变条带的琼脂糖凝胶电泳迁移率。为避免此现象，电泳前需处理样本或分子量标准。样本处理方法如下：样本或分子量标准与Fermentas公司6X DNA Loading Dye & SDS溶液(#R1151)混合；70C加热5分钟或65C加热10分钟后冰浴保存。 转化时，连接产物的体积不能超过感受态细胞体积的10%。 电转化之前，先用氯仿抽提方法除去连接混合物中
6、的T4 DNA Ligase。然后经乙醇沉淀纯化抽提产物。操作手册DNA插入片段与载体DNA连接 1.反应体系配方如下： 组分粘性末端连接平末端连接线性载体DNA20-100 ng插入片段 DNA与载体的摩尔比为1:1到5:110X T4 DNA Ligase buffer2 l50% PEG 4000 溶液*-2 lT4 DNA Ligase0.2 l (1 u)1 l (5 u)水，无核酸酶 (#R0581)至 20 l总体积20 l20 l * 50% PEG 4000溶液随Fermentas T4 DNA Ligase配套提供(#EL0335，#EL0334)。2.粘性末端：22C孵育
7、10分钟；平末端：22C孵育1小时。3.65C热失活10分钟。4.转化：每50 l化学感受态细胞使用5 l连接产物；每50 l电转感受态细胞使用1-2 l连接产物。备注：如需增加转化子数量： 如果连接产物的产量不够，建议4C孵育连接过夜。 采用氯仿抽提替换热失活方法，平末端连接产物建议采用电转化方法。线性DNA自身环化 1. 反应体系配方如下： 线性载体 DNA10-50 ng10X T4 DNA Ligase buffer5 lT4 DNA Ligase1 l (5 u)水，无核酸酶 (#R0581)至 50 l总体积50 l2.充分混匀后短暂离心，22C孵育1小时。3.65C热失活10分钟
8、。4.取大约5 l连接产物转化50 l化学感受态细胞。备注采用氯仿抽提替换热失活方法，平末端连接产物建议采用电转化方法。 接头连接 双链寡核苷酸接头常用于产生插入片段中没有的兼容性突出末端。接头含有限制酶识别位点，与目标片段连接后酶切可产生与克隆载体匹配的粘性末端。此外接头也可直接带有匹配的粘性末端，与克隆载体直接连接，无需额外操作。1.根据应用不同，准备下列的反应体系：组分连接，用于后续酶切仅仅连接线性 DNA5 l (100-500 ng)磷酸化接头5 l (1-2 g)10X T4 DNA Ligase buffer-2 l限制酶用10X buffer2 l-ATP, 10 mM*1 l
9、 (终浓度0.5 mM)-50% PEG 4000 溶液*2 lT4 DNA Ligase (#EL0334) 或 (#EL0335)0.4 l 或 2 l (2 u)水，无核酸酶 (#R0581)至 20 l总体积至 20 l至 20 l* 混合10 l 100 mM ATP溶液(#R0441)和90 l水(无核酸酶，#R0581)制备10 mM ATP溶液。* 50% PEG 4000溶液随Fermentas T4 DNA Ligase配套提供(#EL0335，#EL0334)。2.充分混匀后短暂离心，22C孵育1小时。3.65C热失活10分钟。备注连接产物酶切前无需纯化，可将限制酶直接加
10、入连接反应混合物中。 T4 DNA Ligase活性分析对照反应 连接酶失活或样本DNA中的杂质会导致连接失败。推荐采用对照DNA(如：Lambda DNA/HindIII DNA Marker (#SM0101)的连接实验分析T4 DNA ligase的活性。1.对照连接混合物准备：Lambda DNA/HindIII DNA Marker (#SM0101)1 l (0.5 g)10X T4 DNA Ligase Buffer2 lT4 DNA Ligase1 u水，无核酸酶 (#R0581)至 20 l总体积至 20 l2. 充分混匀后短暂离心，22C孵育10分钟。3. 制备上样混合物：
11、连接产物10 l6X DNA Loading Dye & SDS Solution2 l图 1.对照实验评价T4 DNA Ligase活性。1 Lambda DNA/HindIII fragments, 未连接2 连接后的Lambda DNA/HindIII结果解释l 出现更高分子量条带且低分子量条带变弱，表明连接酶有活性。l 连接后条带不发生变化，说明连接酶失活。参考文献：1 Rossi, R., et al., Functional characterization of the T4 DNA Ligase: a new insight into the mechanism of acti
12、on, Nucleic Acids Res., 25, 2106-2113, 1997.2 Cherepanov, A.V., et al., Binding of nucleotides by T4 DNA Ligase and T4 RNA Ligase: optical absorbance and fluorescence studies, Biophys. J., 81, 3545-3559, 2001.3 Nilsson, M., et al., RNA-templated DNA ligation for transcript analysis, Nucleic Acids Re
13、s., 29, 578-581, 2001.4 Weiss, B., et al., Enzymatic breakage and joining of deoxyribonucleic acid, J. Biol. Chem., 243, 4543-4555, 1968.5 Pheiffer, B.H., Zimmerman, S.B., Polymer-stimulated ligation: enchanced blunt- or cohesive-end ligation of DNA or deoxyribo-oligonucleotides by T4 DNA ligase in polymer solutions, Nucleic Acids Res., 11, 7853-7871, 1983.
