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1、第八章 线粒体疾病的遗传线粒体是真核细胞的能量代谢中心，其内膜上富含呼吸链-氧化磷 酸化系统的酶复合体，可通过电子传递和氧化磷酸化生成ATP，为细 胞提供进行各种生命活动所需要的能量。大量研究表明，线粒体内含 有 DNA 和转译系统，能够独立进行复制、转录和翻译，是许多人类 疾病的重要病因。第一节 人类线粒体基因组线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)是独立于细胞核染 色体外的又一基因组，被称为人类第25号染色体，遗传特点表现为 非孟德尔遗传方式，又称核外遗传。mtDNA分子量小，结构简单， 进化速度快，无组织特异性，具有特殊的结构特征、遗传特征和重要 功能，而且在
2、细胞中含量丰富(几乎每个人体细胞中都含有数以百计 的线粒体，一个线粒体内有210个拷贝的DNA),易于纯化，是研 究基因结构和表达、调控的良好模型，在人类学、发育生物学、分子 生物学、临床医学、法医学等领域受到广泛的重视，并取得令人瞩目 的成就。1981年,Anderson等人完成了人类线粒体基因组的全部核苷酸序 列的测定。 mtDNA 所含信息量小，在呼吸链-氧化磷酸化系统的 80 多种蛋白质亚基中，mtDNA仅编码13种，绝大部分蛋白质亚基和其 他维持线粒体结构和功能的蛋白质都依赖于核DNA (nuclear DNA, nDNA)编码，在细胞质中合成后，经特定转运方式进入线粒体。此 外,
3、mtDNA基因的表达受nDNA的制约，线粒体氧化磷酸化酶系统 的组装和维护需要nDNA和mtDNA的协调，二者共同作用参与机体 代谢调节。因此线粒体是一种半自主细胞器，受线粒体基因组和核基 因组两套遗传系统共同控制(图8-1)， nDNA 与 mtDNA 基因突变均可导致线粒体中蛋白质合成受阻，细胞能量代谢缺陷。图8-1 mtDNA与nDNA的协同作用一、线粒体基因组的结构线粒体基因组全长16569bp，不与组蛋白结合，呈裸露闭环双链 状，根据其转录产物在CsCl中密度的不同分为重链和轻链，重链H 链）富含鸟嘌吟，轻链（L链）富含胞嘧啶。mtDNA 分为编码区与非编码区，编码区为保守序列，不同
4、种系 间 75%的核苷酸具同源性，此区包括37个基因：2 个基因编码线粒体 核糖体的rRNA（16S、12S），22个基因编码线粒体中的tRNA，可满 足线粒体蛋白质翻译中所有密码子的需要，13个基因编码与线粒体氧 化磷酸化（OXPHOS）有关的蛋白质，其中3个为构成细胞色素c氧 化酶（COX）复合体（复合体W）催化活性中心的亚单位（COXI、 COXII和COXIII），这三个亚基与细菌细胞色素c氧化酶是相似的， 其序列在进化过程中是高度保守的；还有2个为ATP合酶复合体（复 合体V） F0部分的2个亚基（A6和A8）； 7个为NADH-CoQ还原酶 复合体（复合体 I）的亚基 ND1、ND
5、2、ND3、ND4L、ND4、ND5 和ND6）；还有1个编码的结构蛋白质为CoQH2-细胞色素c还原酶复 合体（复合体III）中细胞色素b的亚基。13个mRNA基因序列都以 ATG （甲硫氨酸）为起始密码，长度均大于编码50个氨基酸多肽所 必需的长度。线粒体基因组各基因之间排列极为紧凑，部分区域还出现重叠， 即前一个基因的最后一段碱基与下一个基因的第一段碱基相衔接，利 用率极高。并有终止密码结构，长度均超过可编码 50 个氨基酸多肽 所必需的长度，无启动子和内含子，缺少终止密码子，仅以U或UA 结尾。基因间隔区只有87bp，占mtDNA总长度的的0.5%。因而， mtDNA 任何区域的突变都
6、可能导致线粒体氧化磷酸化功能的病理性 改变。mtDNA有两段非编码区，一是控制区（control-region, CR）,又 称 D 环区（displacement loop region, D-loop）,另一个是 L 链复制起 始区。D环区位于双链3端，多为串联重复序列。D环区由1122bp 组成（图8-2），与mtDNA的复制及转录有关，包含H链复制的起始 点（OH）、H链和L链转录的启动子（PH1、PH2、PL）以及4个保守序HH1 H2 L列（分别在 213235、299315、346363bp和终止区16147 16172bp）。图8-2线粒体基因组mtDNA突变率极高，多态现象比
7、较普遍，两个无关个体的mtDNA 中碱基变化率可达 3%，尤其 D 环区是线粒体基因组中进化速度最快 的DNA序列，极少有同源性，而且参与的碱基数目不等，其16024nt 16365nt （nt:核苷酸）及73nt340nt两个区域为多态性高发区，分 别称为高变区I （ hypervariable region I ， HV I ）及高变区II（hypervariable regionH，HVII），这两个区域的高度多态性导致了个 体间的高度差异，适用于群体遗传学研究，如生物进化、种族迁移、 亲缘关系鉴定等。二、线粒体DNA的复制mtDNA可进行半保留复制，其H链复制的起始点（0丿与L链H复制
8、起始点（OL）相隔2/3个mtDNA。复制起始于控制区L链的转 录启动子，首先以L链为模板合成一段RNA作为H链复制的引物， 在DNA聚合酶作用下，合成一条互补的H链，取代亲代H链与L链 互补。被置换的亲代H链保持单链状态，这段发生置换的区域称为置 换环或D环，故此种DNA复制方式称D-环复制。随着新H链的合 成，D环延伸，轻链复制起始点OT暴露，L链开始以被置换的亲代HL链为模板沿逆时针方向复制。当H链合成结束时，L链只合成了 1/3, 此时mtDNA有两个环：一个是已完成复制的环状双链DNA，另一个 是正在复制、有部分单链的DNA环。两条链的复制全部完成后，起 始点的RNA引物被切除，缺口
9、封闭，两条子代DNA分子分离（图 8-3）。新合成的线粒体DNA是松弛型的，约需40分钟成为超螺旋状 态。图8-3 D-环复制多细胞生物中，mtDNA复制并不均一，有些mtDNA分子合成活 跃，有些mtDNA分子不合成。复制所需的各种酶由nDNA编码。mtDNA的复制形式除D环复制外，还有0复制、滚环复制等， 相同的细胞在不同环境中可以其中任何一种方式复制，也可以几种复 制方式并存，其调节机制不明。三、线粒体基因的转录与核基因转录比较，mtDNA的转录有以下特点：两条链均有 编码功能：重链编码2个rRNA、12个mRNA和14个tRNA；轻链 编码1个mRNA和8个tRNA；两条链从D-环区的
10、启动子处同时开 始以相同速率转录，L链按顺时针方向转录，H链按逆时针方向转录； mtDNA的基因之间无终止子，因此两条链各自产生一个巨大的多 顺反子初级转录产物。H链还产生一个较短的、合成活跃的RNA转 录产物，其中包含2个tRNA和2个mRNA；tRNA基因通常位于 mRNA基因和rRNA基因之间，每个tRNA基因的5端与mRNA基因 的3,端紧密相连，核酸酶准确识别初级转录产物中tRNA序列，并在 tRNA两端剪切转录本，形成单基因的mRNA、tRNA和rRNA，剪切 下来的mRNA无5帽结构，在polyA聚合酶的作用下，在3端合成一 段polyA，成为成熟的mRNA。初级转录产物中无信息
11、的片段被很快 降解；mtDNA的遗传密码与nDNA不完全相同：UGA编码色氨酸 而非终止信号，AGA、AGG是终止信号而非精氨酸，AUA编码甲硫 氨酸兼启动信号，而不是异亮氨酸的密码子；线粒体中的tRNA兼 用性较强，其反密码子严格识别密码子的前两位碱基，但第3 位碱基 的识别有一定的自由度（称碱基摆动），可以识别 4 种碱基中的任何 一种，因此，1 个 tRNA 往往可识别几个简并密码子，22 个 tRNA 便 可识别线粒体 mRNA 的全部密码子（表 8-1）。与 nDNA 比较，线粒 体密码子的第3位更常见的是A或C,这是线粒体密码子简并性的主 要来源。表8-1丙氨酸（Ala）的tRNA
12、反密码子摆动宓 777 了反密码子密码子核 tRNA线粒体 tRNAGCU、GCCGCA、GCGGGCUGCUGC第二节 线粒体基因的突变自从 1988 年发现第一个 mtDNA 突变以来，已发现 100 多个与疾 病相关的点突变、200 多种缺失和重排，大约 60%的点突变影响 tRNA， 35%影响多肽链的亚单位，5%影响rRNAo mtDNA基因突变可影响 OXPHOS 功能，使 ATP 合成减少，一旦线粒体不能提供足够的能量 则可引起细胞发生退变甚至坏死，导致一些组织和器官功能的减退， 出现相应的临床症状。一、突变率mtDNA突变率比nDNA高1020倍，其原因有以下几点： mtDNA
13、中基因排列非常紧凑，任何mtDNA的突变都可能会影响到 其基因组内的某一重要功能区域;mtDNA是裸露的分子，不与组 蛋白结合，缺乏组蛋白的保护；mtDNA位于线粒体内膜附近，直 接暴露于呼吸链代谢产生的超氧离子和电子传递产生的羟自由基中， 极易受氧化损伤。如：mtDNA链上的脱氧鸟苷（dG）可转化成羟基 脱氧鸟苷（8-OH-dG）,导致mtDNA点突变或缺失；mtDNA复制 频率较高，复制时不对称。亲代H链被替换下来后，长时间处于单链 状态，直至子代L链合成，而单链DNA可自发脱氨基，导致点突变； 缺乏有效的DNA损伤修复能力。确定一个mtDNA是否为致病性突变，有以下几个标准：突变 发生于
14、高度保守的序列或发生突变的位点有明显的功能重要性；该 突变可引起呼吸链缺损；正常人群中未发现该mtDNA突变类型， 在来自不同家系但有类似表型的患者中发现相同的突变；有异质性 存在，而且异质性程度与疾病严重程度正相关。二、突变类型mtDNA突变类型主要包括点突变、大片段重组和mtDNA数量减 少。（一）点突变点突变发生的位置不同，所产生的效应也不同。已知的由mtDNA 突变所引起的疾病中， 2/3 的点突变发生在与线粒体内蛋白质翻译有 关的tRNA或rRNA基因上，使tRNA和rRNA的结构异常，影响了 mtDNA 编码的全部多肽链的翻译过程，导致呼吸链中多种酶合成障 碍；点突变发生于mRNA
15、相关的基因上，可导致多肽链合成过程中的 错义突变，进而影响氧化磷酸化相关酶的结构及活性，使细胞氧化磷 酸化功能下降。（二）大片段重组mtDNA的大片段重组包括缺失和重复，以缺失较为常见。大片 段的缺失往往涉及多个基因，可导致线粒体OXPHOS功能下降，产 生的ATP减少，从而影响组织器官的功能。最常见的缺失是848313459位碱基之间5.0kb的片段，该缺失 约占全部缺失患者的1/3，故称“常见缺失”（common deletion），由 于 A& A6、COXlII、ND3、ND4L、ND4、ND5 及部分 tRNA 基因的 丢失，造成OXPHOS中某些多肽不能生成，ATP生成减少，多见于
16、 Kearns-Sayre综合症（KSS）、缺血性心脏病等；另一个较为常见的缺 失是863716073位碱基之间7.4kb的片段，两侧有12bp的同向重复 序列，丢失了A6、COXII、ND3、ND4L、ND4、ND5、ND6、cytb、 部分tRNA和D-环区的序列，多见于与衰老有关的退行性疾病；第三 种常见的缺失是第4389至14812位10.4kb的片段，由于大部分基因 丢失，能量代谢受到严重破坏。引起 mtDNA 缺失的原因可能是 mtDNA 分子中同向重复序列的 滑动复制或同源重组，典型疾病为 KSS、慢性进行性眼外肌瘫痪 （CPEO）等。（三）mtDNA数量减少mtDNA 数量的减少可为常染色体显性或隐性遗传，即提示该病 由核基因缺陷所致线粒体功能障碍。三、突变的修复过去人们认为线粒
