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1、果蝇及其他物种杂交、遗传分析 果蝇杂交、同工酶及分子标记系列分析实验摘 要：本实验在果蝇杂交实验的基础上，结合同工酶分析实验和遗传分子标记实验，利用果蝇杂交实验获得的材料，进一步从基因组和蛋白水平上对不同物种或同一物种不同个体之间的差异以及遗传性亲缘关系和进化关系等方面进行分析。关键词：黑腹果蝇 伴性遗传 杂交 同工酶 SSR分子标记A series of experiments of Drosophila hybridization，isozyme analysis and molecular markerAbstract：This experiment is based on Drosop
2、hila hybridization, associated with isozyme analysis and genetic molecular markers analysis. Making use of the materials gathered in the hybridization, from the level of genome and protein, discuss differences between different species or different individuals of the same species and genetic or evol
3、utionary relationships. Key Words：Drosophila melanogaster sex-linked inheritance hybrid isozyme SSR 果蝇性染色体上的基因传递方式与雌雄性别有关，这种伴性基因的遗传方式称为伴性遗传（sex-linked inheritance）。果蝇的性染色体有X和Y两种，雌性是XX，为同配性别；雄性是XY，为异配性别。伴性基因主要位于X染色体上，而Y染色体上没有相应的等位基因，果蝇的红眼与白眼是一对相对性状，关系为红眼对白眼完全显性。当红眼雌性果蝇和白眼雄性果蝇杂交，子一代（F1）中的果蝇均为红眼，子二代（F2
4、）中红眼果蝇白眼果蝇=31，其中雌果蝇中全为红眼，在雄果蝇中红眼果蝇白眼果蝇=11。当反交时，即红眼雄性果蝇和白眼雌性果蝇杂交，F1中的雌果蝇都为红眼，雄果蝇都为白眼；F2中红眼果蝇白眼果蝇=11，在雌果蝇或雄果蝇中红眼果蝇与白眼果蝇的比例均为11。这一结果说明果蝇的眼睛颜色这一性状的决定基因存在于X性染色体上。同工酶是催化反应相同但结构和理化性质不同的一组酶，不同物种的同工酶的活性与分子量均有所差异。本实验对小鼠肝组织，鱼组织，大果蝇D.Virilis，黑腹果蝇Drosophila melanogaster（三隐形品系亲本及子二代）的酯酶（Est）和乳酸脱氢酶（LDH）进行酶活性与分子量的比
5、较分析，结果表明不同物种的同工酶活性及分子量有差异，同一物种，不同品系的个体其同工酶的活性与分子量也不相同。遗传学研究的一个核心问题就是基因的结构与功能。除了大规模的基因组测序外，遗传分子标记实验是研究基因组结构的有效途径。随着聚合酶链式反应（PCR）的广泛应用，多种以PCR为基础，设计特殊引物扩增DNA的分子标记技术应运而生，如RAPD、DAF、SSR等。其中，SSR因在真核生物基因组中广泛分布且操作简单快速而被广泛应用于生物的基因定位和分离、连锁和系统演化等方面的研究。1. 果蝇的伴性遗传杂交实验 1.1 实验原理1.1.1 果蝇杂交实验设计与分析果蝇的野外采集与鉴定:果蝇的生活力很强，野
6、外采集非常方便。若在实验室收集，可在培养瓶中装八一些即将腐烂的水果，如苹果、香蕉等吸引果蝇，待果蝇进入培养瓶后盖上瓶口，进行培养观察，将野外采集的果蝇接入麻醉瓶中，待麻醉后倒在一张向纸上进行观察选种。选种时利用毛笔、放大镜对野外采集的果蝇的体色、眼色、刚毛的形状以及身体大小琴遗传性状进行观察记录，将实验室培养的突变体果蝇和野外采集的果蝇进行比较观察，挑选合适的果蝇进行果蝇杂交实验。果蝇的伴性遗传杂交实验:位于性染色体上的基因叫作伴性基因，其遗传方式与位于常染色体上的基因有一定差别，它在亲代与子代之间的传递方式与雌雄性别有关，伴性基因的这种遗传方式称为伴性遗传（sex-linkedinherit
7、ance）。果蝇的染色体有X和Y两种，雌性是XX，为同配性别；雄性是XY，为异配性别。伴性基因主要位于X染色体上，而Y染色体上没有相应的等位基因，所以这类遗传也叫X-连锁遗传。 果蝇的红眼与白眼是一对相对性状，由单基因控制，位于X染色体上，基因之间的关系为红眼对白眼完全显性。当红眼果蝇（）和白眼果蝇（）杂交，F1代中的果蝇均为红眼，F2代中红眼果蝇白眼果蝇=31，但在雌果蝇中全为红眼，在雄果蝇中红眼果蝇白眼果蝇=11。当反交时，F1代中的雌果蝇为红眼，雄果蝇却为白眼。F2代中红眼果蝇白眼果蝇=11，在雌果蝇或雄果蝇中红眼果蝇与白眼果蝇的比例均为11。正交： 白眼雌红眼雄 反交： 红眼雌白眼雄
8、P： XwXwX+Y P： X+X+ XwY F1： X+XwXwY F1： X+XwX+YF2： X+Xw XwXw X+Y XwY F2： X+X+X+Xw X+Y XwY表型: + w + w 表型: + + + w 选取处女蝇的必要:由于雌蝇体内有贮精囊，一次交配可校长时间地贮存许多有活性的精子，以供多次排卵受精使用，因此在杂交前必须选取处女蝇，以确保得到准确可靠的实验结果，选处女蝇时，首先要放掉培养瓶中的全部老蝇，然后于10h内(雌蝇在孵出后12h内一般不进行交配，为保险起见确定为10h内)选择新孵出的雌蝇单独收集备用。1.1.2 果蝇的生长周期果蝇的整个生活周期分为4个时期，分别为
9、卵、幼虫、蛹和成虫阶段，1012天为一个世代。饲养果蝇的最适温度为2025。下图为果蝇的生活史。图1. 果蝇生活史示意图1.2 实验目的1.学会果蝇的野外采集与鉴定，掌握果蝇杂交技术和运用统计学原理处理数据的方法。2.通过果蝇杂交实验加深理解遗传伴性遗传规律。1.3 实验准备1.3.1 实验材料黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)突变品系：三隐性 (XwXw XwY)野生型品系：野生型 (X+X+ X+Y)1.3.2 实验式剂和主要仪器设备实验试剂：乙醚，玉米粉、琼脂、白糖、酵母粉、丙酸。仪器设备：实体解剖镜，手持放大镜，麻醉瓶，培养瓶(250mL广口瓶)，塑料板，毛笔，
10、试剂瓶。1.3.3 方法培养基配制 玉米粉 28g，白糖 22g，水270mL，琼脂 2.5g，酵母粉 2.5g，丙酸 2mL。混匀加热并煮沸后，倒入培养瓶，晾至自然凝固。 果蝇麻醉轻拍培养瓶口，使聚集在瓶口的果蝇掉落至瓶底，直到瓶口不再有果蝇后，取开瓶塞，将另一空的麻醉瓶口对准果蝇培养瓶，用光诱法引诱果蝇向麻醉瓶移动。果蝇全部移动至麻醉瓶后，迅速用塑料板将两个瓶口隔开，各自盖好。在麻醉瓶瓶盖上放一棉球，滴加乙醚7滴左右，盖在麻醉瓶上，直到果蝇停止活动。果蝇性别的鉴定雄性雌性体型较小较大腹部形态腹部窄小，腹背有3条条纹，腹背后端呈明显黑色腹部浑圆，宽厚，有5条条纹。性梳有，位于第一对足的跗节基
11、部无1.4 实验操作与步骤1.4.1收集处女蝇9月22号，放飞培养瓶内成蝇，10小时内用光诱法将果蝇引诱到空的培养瓶，等果蝇全部爬进毒瓶，用沾有乙醚的棉球置于瓶盖处，盖上毒瓶。等到果蝇麻醉程度至停止活动，停止麻醉并收集处女蝇，雌蝇单独放入小指管内，雄蝇放入大试管内；9月23早7:00和晚上10:00收集处女蝇，方法同上。1.4.2 果蝇杂交亲代培养与杂交培养瓶中分别装入野生雄性（XWY）和三隐形雌性（XwXw）各11只对雌雄果蝇混合培养，此组作为正交；再分别将三隐性雄性（XwY）12只和野生型雌性（XWXW）10只装入同一有培养基的培养瓶内杂交，作为反交。贴好标签，做好标记（9月28日-9月3
12、0日）。各组放入生化培养箱中培养，培养温度为37，每天进行果蝇生长周期观察，培养9 d。F1代培养、收集与杂交培养9天后（10月8日），放飞亲本，继续培养F1，将新生长的成虫果蝇引诱到毒瓶中麻醉，观察并统计成虫性别和眼睛颜色。连续收集统计3天。持续3天（10月12日至15日)收集F1代。10月16日，从正反交F1中各取雌雄性10只，在广口瓶内杂交，做好标记，37培养，培养7天。剩余F1代果蝇进行表型观察并记录，收集冻存。F2代培养、收集与杂交7天后（10月23日），放飞F1代，继续培养F2代，培养5天。5天后，F2开始羽化，将新生长的成虫果蝇引诱到毒瓶中麻醉，观察并统计成虫性别和眼睛颜色。连续
13、收集统计3天（10月28、29日）。1.5 实验结果与分析讨论1.5.1数据记录由于在10月8号放飞亲本蝇时，最终F1代收集到的总数为112只，正交F1雌性全为红眼，雄性全为白眼；反交F1全部为红眼，数据见表1：表1. 果蝇F1代统计结果雌性()雄性()正交2917反交3630表2. 果蝇F2代统计结果F2代本小组经10月28、29日两天的收集，总计收集到673只果蝇，详见表2：正交反交红眼白眼总计红眼白眼总计雌性()140111251雌性()3360336雄性()137113250雄性()204133337总计277224501总计540133 6731.5.2 统计分析果蝇杂交世代图谱如下：正交： 白眼雌红眼雄 反交： 红眼雌白眼雄 P： XwXwX+Y P： X+X+ XwYF1： X+XwXwY F1： X+XwX+YF2： X+Xw XwXw X+Y XwY F2： X+X+X+Xw X+Y XwY表型: + w + w 表型:+ + + w理论： 1 : 1 : 1 : 1 理论： 2 ： 1 ： 1实际： 140 : 111 : 137 : 113 实际： 336 : 204 : 133 统计数据的2检验根据统计公
