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1、常用标本制备技术一、常用光镜标本制备技术1 切片标本的制备：常用的切片方法为石蜡切片，其制备程序如下：取材从动物身体割取所需的新鲜组织一小块（厚度约0.5厘米）。手术愈快愈好，以防组织的死后变化。固定把切取的小块组织，迅速投入预先配好的固定液如10%福尔马林、0.5%娥酸、包氏液、岑克氏液、卡氏等固定液中固定，使组织细胞的蛋白 质变性，组织块硬化，以保存组织细胞原有的形态。冲洗（洗涤）组织块自固定液取出后，须经流水冲洗或乙醇洗涤，使组 织 中含有的固定液全部除去，直至洗净为止。脱水的目的在于除去组织中的水分。因为组织中的水分和石蜡是不相溶 的，为不使组织块在脱水时产生收缩，所以一定要经过各级浓
2、度的脱水剂（如 乙 醇等）将水分脱净。透明组织块脱水后，须经既可和乙醇相混，亦可作石蜡溶剂的透明剂（如 二甲苯）透明，使组织中的乙醇被透明剂所替代，才能浸蜡包埋。浸蜡是将包埋剂（石蜡）透入整个组织的过程。石蜡透入组织需要一定 的 温度（石蜡熔点）。所以浸蜡都在恒温箱中进行。包埋制备一定形状的容器（如纸盒等），倒入熔化的石蜡，迅速夹取浸透 石蜡的组织块放入盒内，待表面石蜡凝固后立即将容器投入水中，使它凝固 成蜡 块。切片组织块经上述处理后，不仅变硬，且有石蜡支撑，可用切片机将包埋 组织的蜡块切成薄片，一般厚度是 5 8 微米。贴片把由切片机切下的蜡条，分割成小段，分别排放于滴有蒸镭水的载玻片上，
3、在展片台上微热，使皱褶的蜡片伸展平正。（10）烘片把贴有蜡片的载玻片置于 45弋恒温箱中，烘烤 34小时，使切 片干 燥。（11）脱蜡与复水组织切片的脱蜡等过程是在染色缸中进行的，因此须预先 准 备洁净的染色缸，并分别放入二甲苯、各级浓度的乙醇及染料溶液，按顺序贴 好标签。染色前须先进行脱蜡和复水，即用二甲苯溶去切片上的石蜡后再经各 级 浓度乙醇（自高浓度到低浓度）下行到水的过程。因为没有经过复水处理的 切片 不能用水溶性染料染色，所以在染色前必须再度复水。脱蜡与复水的步骤 如下：切片浸入二甲苯310分钟T二甲苯+纯乙醇（1：1） T纯乙醇T95%乙醇T80%乙醇T70%乙醇T50%乙醇（以上
4、每级乙醇停留的时间约25分钟）今蒸馆 水2分钟。（12）染色切片染色以后可增加组织细胞结构的对比度。常用的生物染料是 苏 木素和伊红，简称 H.E.染色。苏木素是一种碱性染料，经苏木素染色的结构呈蓝紫色（如细胞 核）。组织中可被碱性染料着色的结构称嗜碱性。伊红是一种酸性染料，被伊 红 染色的结构呈红色或粉红色（如细胞质）。可被酸性染料着色的结构称嗜酸 性。 H.E.染色的程序如下：将已浸入水中的切片取出放入苏木素染液 510分钟 T 自来水洗2分钟 T0.5%盐酸水分色数秒种（在显微镜下检查核褪至浅红色，细胞质及结缔组 织 近无色）T蒸馆水1分钟T0.1%氨水（蓝化）1分钟T自来水冲洗510分
5、钟T蒸馅水1分钟T50%乙醇 T70%乙醇T80%乙醇T90%乙醇（以上每级乙醇停留的时间约25分钟）T0.5%伊红（95%乙醇溶液）25分钟T95%乙醇分色（在显微镜下检查核呈 蓝紫色，细胞质及结缔组织呈粉红色）T95%乙醇轻洗（洗净玻片上剩余的伊红染 液）。（13）脱水已染色的组织切片，为了长久保存，又须再经各级浓度的乙醇脱 水。即将上述已被染色的组织切片依次放入95%乙醇1分钟T纯乙醇（|） 1分钟 T 纯乙醇（ ） 25 分钟。（14）透明的目的是除去组织切片中的乙醇，因组织中的乙醇不与树胶相溶， 所以必须用透明剂除去乙醇后才能封藏。即将上述已脱水的组织切片依次放入二甲 苯 +纯乙醇（
6、1：1）25分钟T二甲苯（|） 25分钟T二甲苯（口）25分 钟。（15）封固在切片上滴加中性树胶，用盖玻片进行封固，保存备用。机体内有些结构成分，需经硝酸银处理（镀银或银染）时可使硝酸银还 原， 形成银的微粒附着在组织结构上，呈棕黑色，称这种性质为亲银性。有些 组织结 构本身不能使硝酸银还原，需加还原剂使硝酸银还原，称此为嗜银性。 此外，为 了显示某些特殊结构成分，还可应用各种特殊染色方法，如雷锁辛品 红染色液显 示弹性纤维等。在制作较硬组织（如骨组织等）或较大组织器官（如眼球）等切片，为了 减 轻因石蜡包埋所产生的收缩，可用火棉胶（celloidin）代替石蜡进行浸透包 埋，再 进行切片染
7、色。为了较好地保存细胞内的酶活性，可选用冷冻切片。它 是将组织 在低温条件下快速冻结，直接切片，进行染色。2、涂片、铺片、磨片标本的制备：血液等液体材料，可直接在玻片上涂片，干燥后再进行固定和染色。疏松 结 缔组织和肠系膜等薄层组织，可在玻片上撕开展平，制成铺片，待干燥后进 行固 定和染色。骨和牙等坚硬组织除用酸（如稀硝酸等）脱钙后再按常规制成 切片 处，还可直接研磨成薄的磨片进行染色观察。二、大体解剖技术操作规程及其注意事项一）大体解剖标本的收集与防腐固定处理1、收集标本时，须登记死者的死亡原因、性别、年龄等，办妥自愿捐献手续、家属签字等手续，免留后患。若系无主尸体亦须在公安、保卫部门办妥有
8、 关手续。2、进行消毒处理，避免传染病蔓延。3、进行固定防腐注射，配制 5%10%的甲醛溶液作颈总动脉与股动脉灌 注，按照标本大小选择注射剂量。如注射溶液过浓，解剖时容易造成肌纤维及 血 管断裂，过淡时标本容易腐败。温度高时注射 5%左右溶液，温度低时注射 10%左 右溶液。根据季节气温的不同在 5%-10%之间浮动。4、注射完后标本在注射台上保留一到两天，使其毛细血管中溶液渗均匀， 再行放入 3%5%的甲醛溶液中保存。5、每具标本注射后必须在尸池中浸泡六个月后，方可进行大体解剖，如解 剖过早则不易保存。6、若收集标本须作铸型标本用，宜将标本即时放血，取材越新鲜越好。剩 余部分作局部注射保存。
9、若作关节韧带等标本，取材后马上将肌肉等及时剥 离， 以防腐败发臭。收集腐败标本后可作沙埋腐蚀后取骨架为标本。（二）大体标本解剖1、将收集保存六个月以上的标本捞出、冲洗后，放入尸体台即可进行解 剖。2、解剖前必须将银、钳、剪、刀等工具准备完好，方可动手操作。视其操 作部位，必须熟悉所作部位解剖层次结构，用圆刀切开皮肤并剥离之，用尖刀 或 剪等修洁神经、血管、肌肉等结构。大体标本制作之关键在于熟悉层次结构 和熟 练的操作技巧。否则易切断或破坏相关结构，且制作的标本不美观。若作 系解教 学标本宜采取两侧分别以深、浅层制作。完成后放入本院配制之保存液 中待用。（三）特殊标本制作1、铸型标本（1）根据所
10、取材料，按需要处理。（ 2 ） 配制好铸型剂并加不同染料（一般示红色动脉，示静脉蓝色，示胆道 绿色，示神经黄色等）。（3） 分别采取不同腐蚀法，腐蚀后冲洗，装瓶保存。2、包埋标本（1）取出所需材料修洁凉干（有条件可抽空包埋）。（2）按需要选择好包埋材料。（3）包埋造型。3、xx 标本制作（1）按要求进行标本取材。（2）xx 涂色。（3）装瓶、保存（若标本上涂色彩，不宜保存在本院配方的保存液中，以 防脱色，仍须保留在 5%-10%的甲醛溶液中）。三、人体骨骼标本双氧水法制作（一）目的利用局解后的废旧材料制作人体骨骼标本（二）材料 经防腐固定的局解后尸体标本、工业用双氧水、汽油和带盖标本箱。（三）
11、方法1、取材：取骨质无损的标本，整体的或局部的均可。2、软组织处理：将大块软组织包括筋膜、肌肉、内脏、脑等除掉后，常温下浸入 5%10%的 双氧水中，利用双氧水放氧产生气泡的机械作用使软组织松动，1530 天后取 出，用清水冲洗后将骨膜撕掉，但韧带、关节囊、软骨、肌腱、骨间膜等可按 需 修洁保留（如做散的骨标本，则可将这些软组织很容易地清除掉）。3、脱脂：将上述材料凉干后入汽油中脱脂 4个月。注意材料要干燥，容器要密封， 中 途更换 1次汽油即可。4、清洁和保存：将脱脂后的材料置通风处让汽油挥发，然后浸入 1%的洗衣粉内将表面的油 渍洗净，再用清水冲洗干净。之后，置阴凉干燥处风干（为防止肋骨缩
12、水变 形， 可用木条或有机玻璃支撑固定，待干后拆掉），涂刷清漆两遍即可保存。（四）结果及评价制作出的骨骼标本洁净美观，结构完整，骨的连结自然真实，骨间膜、椎 间 盘、肋软骨、耻骨间盘、韧带、关节囊、关节软骨等牢固地与骨连结在一 起，胸 廓，骨盆，脊椎等完全保持了其本来形态。采用双氧水浸泡处理软组 织，有以下 优点：（1）双氧水放氧产生氧泡的物理作用使与骨结合紧密的软组织松动，与骨 较易分离，而干燥后这些软组织与骨的结合又变得紧密牢固了。（2）经双氧水浸泡后骨标本脱脂效果很好。（3）低浓度的双氧水对骨质的腐蚀性小，在常温下进行，处理的时间容易 控制。四、辣根过氧化物酶（HRP）法操作规程（一）实
13、验目的探讨某一针灸穴位区传入神经元的节段性分布。（二）药品和试剂HRP：Sigma Type IV RZ：3.2硝普钠（XX化学试剂厂）联大茴香胺（XX化学试剂厂）过氧化氢（XXXX化工厂）（三）仪器设备与材料100ml量筒、分析天平、500ml量筒、1000ml烧杯、2000ml烧杯、家免饲 养笼、 50山微量注射器、精密试纸、普通光学显微镜，等。四）实验对象 本院动物室提供的家兔，体重 200020go（五）实验环境室温18259，相对湿度60%75%0（六）操作步骤1. 主要溶液的制备20%HRP液20山、HRP粉末5mg加20山生理盐水即此液。（2）2%多聚甲醛加1.25%戊二醛0.1
14、M磷酸缓冲液(PH7.4)。 0.1M磷酸缓冲液的制备：I液：NaH2PO4 H2O27.6g加蒸憎水稀释至lOOOmloII 液：Na2HPO4-12H2O71.6g加蒸憎水稀释至1000ml.取I液190m卜II液810ml混合后加蒸镭水稀释至2000ml即得0.1M磷酸缓冲液(PH7.4)。 2%多聚甲醛0.1M磷酸缓冲液的制备:20g多聚甲醛加0.1M 磷酸缓冲至 1000ml 即得此液。 2%多聚甲醛1.25%戊二醛0.1M 磷酸缓冲液的制备:25%戊二醛 50ml 溶液加 2%多聚甲醛0.1M 磷酸缓冲液至 1000ml 即得。(3) Tris液的配制 取3.6ml冰醋酸加蒸镭水至
15、300mlo 取4.08g 无水醋酸钠加蒸馅水至 150mlo 取上液279ml和上液126ml混合，即为Tris液。 混合后用精密试纸测其 PH 为4.4则可用。(4) 0 D 法中有关溶液配制 A 液的配制取O.lMTris 液 10m卜0.2%明明胶液50ml、硝普钠200mg加蒸馅水至100mk联大茴香胺80mg加蒸 镭水至 40ml、1.5%H2O20.8ml混合即得A液。 B 液的配制取O.lMtris 液 10mk0.2%明胶液50ml、硝普钠8g、蒸镭水140ml混合即得B液。 C 液的配制取O.lMtris 液 20ml、0.2%明胶液100ml蒸慵水280ml混合即可得C液。2. 定穴及针入 xx：根据针灸学1、兽医针灸手册2确定。3. 动物分组、xx及HRP引入方式：将实验用家兔随机分成 5 组，即穴区组神经干组、切断神经组、切断血管 组和空白对照组。用 2%戊巴比妥纳、接 40mg/kg 体重，进行腹腔麻醉。穴区组、切断神经组、切断
