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1、欧洲药典蛋白含量测定方法欧洲药典中蛋白含量的测定方法1.欧洲药典第 7 版 2.5.33, USPBiotechnology-derived articles-Total protein assay。EP2.5.33收录了 7种检测方法，即扫描法、Lowry法、Bradford法、BCA法、 Biuret 法、荧光法和氮分析法。 1.1 扫描法：原理：依据蛋白质结构中含有芳香族氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），其在280nm 处有吸光值。检测时,如果溶解蛋白质的溶剂也有高吸光度,则采用干扰对照液 进行补偿消除。但如果干扰对照液吸光值也很高，则检测结果误差大。此外，低 浓度蛋白质溶液会因蛋白质吸附至检
2、测池上而影响浓度，后者可使用高浓度或用 去离子去污剂处理样品。待测品：蛋白质溶液浓度一般为0.2mg/mL2 mg/mL。对照品：选择合适的对照品，用溶解待测品蛋白质的溶剂配制，浓度与待测品 溶液一致。 检测：检测过程中，将待测蛋白溶液、对照品溶液和干扰对照液保 持在相同温度。使用石英比色皿检测280nm处吸光值，并使用规定的溶液进行补 偿。溶液浓度应尽可能保持在适宜范围内以便获取准确结果。光散射影响：样品引起的光散射会导致蛋白质检测结果准确度降低。如果蛋白 质溶液中存在颗粒大小与检测波长（250nm到300nm）相当的颗粒，光散射将导 致样品的吸光值大大增加。为了校正光散射引起的在280nm
3、处的吸光值，则可检 测待测样品在320nm、325 nm、330 nm、335 nm、340 nm和350 nm处的吸光值， 以所得的吸光值对数值为纵坐标，以检测波长对数值为横坐标作图，并通过线性 回归确定标准曲线，将曲线延伸到280nm，得到280nm处吸光值的对数，再通过 反对数计算获得280nm处由光散射引起的吸光值。从检测的总吸光值中扣除光散 射引起的吸光值即为样品吸光值。用0. 2um滤膜过滤或离心可减少光散射作用， 特别是明显浑浊的蛋白溶液。计算：应使用校正过的吸光值进行计算，按下列公式进行计算。CU=CS （AU/AS）其中，CS为对照液浓度，AU、AS分别为单侧样品和对照液的校
4、正后的吸光值。1.2 Lowry 法：原理：此方法是依据蛋白质中的酪氨酸能将磷钼酸-钨酸混合物还原，还原后 物质在750nm处有最大吸收值。室温下，其颜色在2030min内最深，随后将随 时间逐渐减弱。这个方法干扰物质较多，因此可使用沉淀法处理蛋白样品。多数 的干扰物质产生较低颜色，一些去污剂可明显加深溶液颜色。可使用高盐沉淀法 提纯蛋白。由于不同蛋白质的吸光强度不同，因此对照品应与待测品一致。如果 有必要除去干扰物质，则应在样品制备前按下述的方法处理。干扰物质的作用也 可通过稀释作用降低，前提是应保证样品溶度符合准确测定的浓度要求。 配制 溶液和试剂的水至少为蒸馏水。待测品：配制适当浓度的待
5、测样品使其浓度处于标准曲线浓度线性范围内。溶 液的pH以10.010.5为宜。对照液：用规定的缓冲液溶解适量的对照蛋白，并用同一种缓冲液稀释成不少 于5个浓度溶液，其浓度适宜范围为5 口 g/ml100 口 g/ml。空白液：使用配制 待测蛋白液和对照蛋白液的缓冲液。硫酸铜试剂：取lOOmg硫酸铜和0.2g酒石酸钠，用水溶解并稀释至50ml。取 10g无水碳酸钠，用水溶解并稀释至50ml。缓慢将碳酸钠溶液倒入硫酸铜溶液中， 混匀24h内使用。碱性铜试剂：取1体积硫酸铜试剂，2体积50g/L十二烷基 硫酸钠溶液和 1 体积 32g/L 氢氧化钠溶液混合。室温下储存，2 周内使用。稀磷钼酸-钨酸试
6、剂：取 5ml 磷钼酸-钨酸试剂和 55ml 水，混匀。储存在棕色 瓶子中，室温保存。（注：USP中规定取10ml福林酚试剂和50ml水混合。）检测：取1.0ml各对照品溶液、待测品溶液、空白对照液，加入1.0ml碱性铜 试剂，混匀，静置10min。加入0.5ml稀磷钼酸-钨酸试剂，混匀，室温静置30min。 检测其750nm处吸光值，并以空白对照液作为补偿。计算：一般情况下，蛋白质浓度与其吸光值关系并不是线性的，但是如果做标 准曲线的浓度范围足够小，则其曲线是线性的。以浓度为横坐标，对应的吸光值 为纵坐标作图，通过线性回归得出标准曲线。由标准曲线和待测蛋白样品的吸光 值即可计算得到待测蛋白样
7、品的浓度。干扰物质：在检测前加入脱氧胆酸-三氯乙酸混合液，沉淀析出蛋白质，除去 干扰物质。这种技术也可用于由稀溶液浓缩的蛋白质。具体操作流程如下：加 1.5g/L的脱氧胆酸0.1ml值1ml待测样品溶液。漩涡振荡混匀，室温静置10min。 加入720g/L三氯乙酸0.1ml并漩涡振荡混匀。3000g离心30min,倾析出上清液 并用移液器除去剩余的溶液。用1ml碱性铜试剂复溶蛋白质沉淀。1.3 Bradford 法：原理：该法是基于酸性蓝90染料可结合于蛋白质上,并在47 0nm 595 nm处具有吸光值。酸性蓝90染料（USP中称为亮蓝G）主要结合蛋白质上得精氨酸 和赖氨酸,而不同蛋白质上所
8、含的精氨酸和赖氨酸不同导致对染料的反应差异, 因此,对照蛋白应与被测蛋白一致。该方法极少有干扰物质,但待测蛋白溶液中 也应避免含有去污剂或两性电解质。强碱性样品可能干扰酸性试剂。配制溶液和试剂的水至少为蒸馏水。 待测品：配制适当浓度的待测样品使其浓度处于标准曲线浓度线性范围内。 对照液：用规定的缓冲液溶解适量的对照蛋白,并用同一种缓冲液稀释成不少 于5个浓度溶液，其浓度适宜范围为0.1mg/ml1mg/ml。空白液：使用配制待 测蛋白液和对照蛋白液的缓冲液。酸性蓝90试剂：取0.10g酸性蓝90染料，用乙醇（96%）溶解并稀释至50ml。 加入100ml磷酸，并用水稀释至1000ml，混匀。溶
9、液过滤（定量滤纸或Whatman 1号纸）后，室温下储存与棕色瓶中。储存过程中慢慢出现沉淀，在使用前应过 滤。检测：取5ml酸性蓝90试剂，加入到0.100ml各对照蛋白溶液、待测蛋白溶 液和空白对照溶液中，混合，翻转混匀。混合时应避免产生泡沫，否则影响实验 重复性。检测其595nm处吸光值，并以空白对照液作为补偿。注意不要使用石英 （二氧化硅）检测池，避免染料结合到这种材料上。计算：见“Lowry法计算”。1.4二喹啉二羧酸法（BCA法）：原理：该法是依据蛋白质可将Cu2+还原为Cu+，而二喹啉二羧酸酸可以检测 Cu+。该法干扰物质较少，可通过稀释减少干扰物质的影响，前提是保证蛋白质 浓度足
10、以满足要求；也可以使用Lowry法中蛋白沉淀法除去干扰物质。因为不同 蛋白种类反应颜色强度不同，因此对照蛋白应与待测蛋白一致。 配制溶液和试 剂的水至少为蒸馏水。待测品：配制适当浓度的待测样品使其浓度处于标准曲线浓度线性范围内。对照液：用规定的缓冲液溶解适量的对照蛋白，并用同一种缓冲液稀释成不少 于5个浓度溶液，其浓度适宜范围为10 口 g/ml1200 口 g/ml。空白液：使用配 制待测蛋白液和对照蛋白液的缓冲液。BCA试剂：取10g二喹啉二羧酸钠，20g 一水合碳酸钠，1.6g酒石酸钠，4g 氢氧化钠和9.5g碳酸氢钠，用水溶解后，如有必要，用氢氧化钠溶液或碳酸氢 钠溶液调节pH至11.
11、25，用水稀释至1000ml并混匀。铜-BCA试剂：取40g/L硫酸铜溶液1ml和50mlBCA试剂混匀。检测：分别取各对照蛋白溶液、待测蛋白溶液和空白对照溶液0.1ml和2ml 铜-BCA试剂，混匀。于37C孵育30min，记录时间并使混合液冷却到室温。孵 育结束后60min内，用石英检测池检测562nm处吸光值，并以空白对照液作为补 偿。当溶液冷却到室温后，溶液颜色逐渐加深。计算：见“Lowry法计算。1.5双缩脲法（Biuret法）：原理：该法是依据蛋白质在碱性溶液中可与Cu2+结合并在545nm处有吸光值。 用此法检测IgG和白蛋白结果差异很小。将氢氧化钠和双缩脲试剂一起加入，或 加入
12、氢氧化钠后混合不足，或延长氢氧化钠和双缩脲试剂间隔时间会使IgG样品 比白蛋白反应程度更强。当待测蛋白样品中蛋白质含量小于500 ug/ml时，前面 所述的用三氯乙酸降低干扰物质影响的方法此方法中也可以使用。配制溶液和试剂的水至少为蒸馏水。待测品：取适量待测蛋白样品，溶于9g/L氯化钠溶液中，使其浓度处于标准 曲线浓度线性范围内。对照液：用9g/L氯化钠溶液溶解适量的对照蛋白，并用9g/L氯化钠溶液稀释 成不少于5个浓度溶液，其浓度适宜范围为0.5mg/ml10mg/ml。（USP中规定为: 除非另有规定，采用人血白蛋白为对照蛋白，其氮-蛋白质转换因子为6.25）空 白液：9g/L氯化钠溶液。
13、双缩脲试剂（Biuret试剂）：取3.46g硫酸铜溶于10ml热水中，冷却（A液）。 取34.6g柠檬酸钠和20.0g无水碳酸钠溶于80ml热水中，冷却（B液）。将A 液和B液混合并用水稀释至200ml，6个月内使用（室温保存）。如果混合液中 出现任何沉淀或浑浊则不可使用。检测：取1体积的待测溶液，加入等量60g/L 氢氧化钠溶液，混匀。立即加入0.4体积双缩脲试剂并快速混匀。于1525C间 某个温度下静置15min。在加入双缩脲试剂90min内，检测545nm处吸光值，并 以空白对照液作为补偿。任何出现浑浊或沉淀的溶也均不可用于检测蛋白质浓 度。计算：在对照液规定的蛋白浓度范围内，蛋白质浓度与其吸光值关系基本上呈 线性的，以蛋白质浓度为横坐标，对应的吸光值为纵坐标作图，通过线性回归得 出标准曲线。计算曲线的相关系数，相关系数应不小于 0.99。由标准曲线和待 测蛋白样品的吸光值即可计算得到待测蛋白样品的浓度。
