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1、ELISA 相关因素实验1 包被抗原使用浓度的确定包被抗原的使用浓度过高，既不经济，又可使本底增高;使用浓度过低，则酶标板上有 大量位点未吸附抗原，增加了非特异性反应，又影响检测的敏感性。所以必须对包被抗原的 使用浓度予以选择。包被抗原使用浓度的确定采用方阵试验法，用系列浓度的包被抗原包被 96孔酶标板，将抗血清做倍比稀释，采用间接ELISA法测定包被抗原的最佳使用浓度。间 接ELISA法的具体步骤如下：A. 包板:用包被缓冲液(CBS)将包被抗原稀释成系列浓度，lOOul/孔，4C过夜。包被抗原的 加法如下表;B. 洗板:PBST洗四次，lmin欣；C. 封闭:5%甘氨酸 PBST, 200
2、ul/孔，37C, 2h;D. 洗板:PBST洗四次，lmin/次;E. 加一抗:加入系列浓度的抗血清，100ul/孔，37C，100min。抗血清加样如下表所示；F. 洗板:PBST洗四次，lmin/次；G. 加二抗:1600倍稀释的HRP酶标山羊抗兔IgG(PBST配制)，100ul/孔, 37C，40min;H. 洗板:PBST洗四次，lmin/次;I. 加底物:200ul TMB 储存液 +10mL 底物缓冲液+7ul H2O2，各 5ul/孔, 37C，15min;J. 终止:2M H2S04，50ul/孔;K. 读数:OD450。包被抗原加样表抗血清加样表加 样 孔 号抗体稀释倍数
3、1PBS2PBS351200X425600X512800X66400X73200X81600X9800X10400X11200X12100XABCDEFGH2 最佳封闭液的选择封闭是指在包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体在包被时所 使用的浓度较低，抗原或抗体吸附后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不 相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中其他干扰物质的再吸附。试 验中选择常用的3%的聚乙二醇(6000), 1%的酪蛋白，5%的甘氨酸,2%的脱脂乳，1%的OVA, 5%的OVA, 1%的明胶和2%的明胶作为封闭液，采用间接ELISA法测定封闭
4、效果。 具体步骤如下:A. 包板：用包被缓冲液(CBS)将包被抗原稀释到最佳使用浓度，100u1/孔，4C过夜；B. 洗板:PBST洗四次，lmin/次；C. 封闭：分别加入3%的聚乙二醇(6000), I%的酪蛋白，5%的甘氨酸，2%的脱脂乳，l%的OVA，5%的 OVA, l%的明胶和 2%的明胶，200ul/孔, 37C, 2h;D. 洗板:PBST洗四次，lmin/次；E. 加一抗：加入1x104512x104倍稀释的抗血清，100ul/孔，37C, l00min。F洗板:PBST洗四次，lmin/次；G. 加二抗：加入1600倍稀释的H即酶标山羊抗兔xgG(PBsT配制)，100ul
5、/孔，37C, 4omin;H. 洗板:PBST洗四次，lmin/次；I. 加底物:TMB 储存液 200ul/孔+10mL 底物 Buffer+7ul H2O2，50ul/孔, 37C, 15min；J. 终止：加入 2M H2SO4，50ul/孔;K. 读数: OD450。3 HRP 酶标抗体使用浓度的确定抗原和抗体的特异性反应只有在合适的浓度比例时才能产生最高的OD值。在用于具体 的 ELISA 检测时，酶标抗体的最适工作浓受到固相载体的性质，包被抗原或抗体的纯度以 及整个检测系统如标本，反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进行试验， 选择能达到高敏感度的最大稀释度作为酶标二
6、抗的适工作浓度。最适的工作浓度就是指酶标 二抗稀释至这一浓度时，产生的本底较低，且可获得定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条 件和测定费用的节省。采用棋盘法进行不同浓度纯化抗清和不同稀释度酶标二抗直接ELISA 实验。步骤如下:A. 将纯化后的血清冻干粉用0.05mol/L pH9.6的CBS重新溶解,稀释成0.1ug/mL、0.5ug/ml、 l ug/mL、5 ug/mL、10 ug/mL、50 ug/mL、100 ug/mL L、500 ug/mL, 100ul/孔分别加到 96 孔。酶标板中，4C过夜。B. 取出酶标板，恢复至室温。PBST洗涤四次，1 min/次；C. 加入用 PBS
7、系列稀释的酶标二抗性,稀释梯度分别为50、 100、 200、 400、 800、1600、3200、6400、12800 倍稀释，37C温育 40min。；D. PBST洗涤四次，lmin/次；E. 每孔分别加入100ul底物溶液，37C温育15min;F. 每孔分别加入50ul 2M H2SO4中止反应，用酶标仪测定其OD450值。4 包被时间对检测效果的影响由于包被抗原的作用时间和温度是影响ELISA检测效果的因素之一，分别选择37C lh， 37C 2h， 37C 3h， 4C 12h， 4C 14h， 37C 2h+4C 12h 六种不同的时间和温度对抗 原进行包被，实验方法用常规间
8、接ELISA实验。5 一抗作用时间对检测效果的影响在间接ELISA试验中，一抗作用时间是影响ELISA检测灵敏度的因素之一，为了提高 检的灵敏度，选择六个不同的一抗作用时间进行试验。分别选择 30min， 40min， 60min， 80min， 100min，120min作为一抗作用时间，用常规间接ELISA实验对检测效果进行观察。6 酶标二抗作用时间对检测效果的影响酶标二抗的作用时间对ELSIA检测的灵敏度也会有影响，为了提高检测灵敏度，选择 六个不同的酶标二抗作用时间进行试验。分别选择30min， 40min， 60min， 80min， 100min 和120min作为酶标二抗作用时间
9、，用常规间接ELISA实验对检测效果进行观察。7 底物作用时间对检测效果的影响底物作用时间是影响ELISA试验稳定性的因素之一，不同的底物作用时间会影响显色 反应。为了提高ELISA检测的稳定性，选择六个不同的底物作用时间进行试验。分别选择 6min，8min，10min，15min，20min和30min作为底物作用时间，实验方法用常规间接ELISA 实验。8 底物配方的优化底物是影响 ELISA 试验稳定性的一个重要因素. 常用的供氢体有邻苯二胺、四甲基联 苯胺(TMB)和ABTS。但是OPD本身难溶于水，曾有报道OPD有致异变性，且稳定性较差。 而且OPD在每次使用时，都必须现用现配，在
10、终止反应后，OD值还会增加。TMB经HRP 作用后产物呈蓝色，目视对比鲜明。且 TMB 性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与 H2O2 溶液混和即成应用液，可直接作底物使用，终止后，其OD值几乎不升高。另外，TMB又 有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。而ABTS不如OPD和TMB敏感。底 物溶液中TMB和H2O2的使用量对试验的灵敏度有影响，因此，为了获得最佳的试验效果, 对TMB和H2O2的使用量进行确定。(1) TMB 使用量的确定:TMB的使用浓度选用0.10.3g/L, H2O2浓度选用0.04%。实验方法用常规间接ELISA实验。(2) H2O2使用量的确定：H2O2:的使用浓度选用0.00010.1%, TMB的使用浓度选用0.2g/L，实验方法为常规间接 ELISA实验。(3) 两因素有重复完全随机试验优化底物试验采用两因素有重复完全随机试验优化底物配方，实验方法为常规间接ELISA实验。9 抗体效价和工作浓度的确定采用间接ELISA法测定效价和工作浓度。10 抗体交又反应性测定采用间接竞争ELISA法。
