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1、实验五 细胞的原代培养和传代培养1. 实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程。2. 实验指导细胞培养(cell culture)是从机体中将细胞取出后，在模拟生物体内生理条件下使其在体外生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命活动过程的方法。进行细胞生物学、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成为一种重要的生物学技术。细胞培养一般可分为原代培养和传代培养。所谓原代培养，是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。一般动
2、物和人的所有组织都可以用于培养，但幼体组织和细胞(如胚胎组织、幼仔的脏器等)更容易进行原代培养。传代培养则是为了使体外培养的原代细胞或细胞株在体外持续生长、繁殖。细胞持续生长繁殖就必须传代，并由此获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞。培养的贴壁细胞形成单层汇合后，由于密度过大、生存空间不足而引起营养枯竭。将培养的细胞分散，从容器中取出，以1：2或1：3以上的比例转移到另外的容器中继续进行培养，即为传代培养。要使细胞在离体情况下生长繁殖，培养条件必须尽可能接近体内，除营养物质外，温度、PH值、生长因子等也至关重要。此外，还应避免细菌及其他微生物的污染，重金属离子及有毒化学物质及放射线的影响。贴壁
3、细胞通过质膜表面的粘着蛋白贴附于培养瓶表面。加入消化液可使粘着蛋白部分水解，从而使培养的细胞游离。但消化时间不可过长，否则可能导致细胞解体死亡。常用的消化液为胰蛋白酶和EDTA。二者可分别使用，也可共同使用。钙离子是二者的抑制剂，故实验中消化结束时，加入含有钙离子的全培养液，即可终止消化。细胞的一代是指细胞从接种到分离再培养的一段时间，与细胞世代或倍增不同，在一代中细胞倍增36次。细胞传代后一般经过三个阶段：游离期、指数生长期和停止期。原代培养和传代培养的细胞依据其生长状态，可分为贴壁生长细胞与非贴壁生长细胞。一般说来，来自外周血的细胞，如红细胞、白细胞、白血病细胞等都是非贴壁细胞；而来自其他
4、组织的细胞则多为贴壁细胞。贴壁细胞依照其镜下特征，可分为以下4种类型。 成纤维型细胞。上皮型细胞。游走型细胞。多形型细胞。本次实验中原代培养的为兔肾成纤维细胞，生长状态良好时为标准的成纤维型细胞。传代培养的HeLa细胞为黑人宫颈癌细胞，为标准的上皮型细胞。3.实验材料3.1器材:手术器械一套，直径9cm培养皿一套，培养瓶4个，吸管3支，离心管2个(以上用品为每只乳兔所用)，C02培养箱，超净工作台，酒精灯，倒置显微镜，HeLa细胞。3.2试剂：0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA混合消化液，RPMI-1640培养液 (含5%小牛血清)，0.01%PBS，75%乙醇。3.3动物：乳兔4.实验
5、方法4.1细胞的原代培养4.1.1方法 取材: 用颈椎脱位法处死乳兔，然后把整个动物浸入盛有75%乙醇的烧杯中，数秒消毒后取出(注意：浸泡时间过长，乙醇从口和肛门侵入体内会影响组织生长)，携入超净台，放在大平皿中。分别用碘酒和乙醇进行一次背部消毒，再用消毒过的剪刀剪开乳兔背部的皮肤和肌肉，取出肾脏，置于另一个无菌培养皿中。切割: 用灭菌的PBS液将取出的肾脏清洗3次，然后用眼科剪刀和镊子仔细将肾脏外包膜除去，之后将组织反复剪碎，直至剪成0.51mm3左右的小块。再用PBS液清洗，直至组织块发白为止。然后移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到离心管的管底，弃去上清液。 消化分离: 吸取
6、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，加上胶塞，在37水浴箱中消化810分钟，每隔几分钟轻轻摇动一下离心管，使组织与消化液充分接触。消化结束后静置3分钟，吸去上清。 接种培养：向离心管中加入510ml含5%小牛血清的1640培养液，用吸管吹打混匀，移入2个培养瓶中。盖好瓶塞，做好标记，置于C02培养箱中37培养。4.1.2结果观察细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，57天即可形成单层。4.2细胞的传代培养4.2.1方法 将长成单层的细胞从CO2培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少量消化液 (以液面覆盖住细胞即可)，之
7、后立即弃掉消化液。静置35分钟，加入35ml新鲜培养液(在酒精灯上进行操作)，吹打，制成细胞悬液。将细胞悬液吸出2ml左石，加入另一无菌培养瓶中(在酒精灯上进行操作)，并向每个培养瓶中分别加入3ml左右培养液，盖好瓶塞，做好标记，送回二氧化碳培养箱中，37继续进行培养。4.2.2结果观察一般情况下，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶的壁上，24天就可在瓶内形成单层，并需要再次传代。5.结果与讨论5.1绘出镜下所见贴壁生长的兔肾细胞及HeLa细胞的形态。5.2讨论在细胞培养的过程中避免污染的关键环节。6.注意事项6.1细胞培养十分重要的事项是整个过程都要注意无菌操作。操作者操作前要洗手，并
8、用75%乙醇消毒或0.2%新洁尔灭泡手。6.2使用的超净工作台在操作前用紫外线照射2030分钟，并打开吹风机。6.3培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞。打开之前要用75%乙醇瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下。打开瓶口后全部操作过程都要在超净台内完成。操作完毕，加上瓶塞，才能拿到超净台外。6.4使用吸管时，从消毒筒(或消毒纸)中取出时要用手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上乳胶皮头，然后再去吸取液体。6.5细胞培养过程中要每隔一日进行常规检查，观察是否有污染，细胞生长是否正常。如果溶液清晰、透亮，细胞贴壁生长并沿壁延伸，说明无污染；如果溶液变黄或浑浊，表明已污染，培养失败。6.6使用CO2培养箱培养时，由于CO2增多，可使液体变黄，这时可更换培养液继续培养。7.思考题7.1细胞原代培养和传代培养有什么区别？培养细胞有何用途？7.2培养细胞为什么会发生形态变异？
