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1、聚乙烯亚胺结合DNA的凝胶阻滞电泳实验实验导读琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定、纯化DNA片段的标准方法。即用低浓度的荧光物质， 插入性染料溴化乙锭使凝胶中 DNA 区带染色，在紫外光下可检测出凝胶中少至 1 ng 的 DNA,故可以直接显示DNA在凝胶中的位置，也可以用于聚阳离子材料对质粒DNA结合 能力的检测。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决于以下四个参数：1）DNA分子的大小：电泳时线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，迁移率与其分 子量的对数成反比。2）琼脂糖浓度：一定大小的 DNA 片段通过不同浓度的琼脂糖凝胶时迁移率也不同。 DNA 电泳迁移率（卩）的对数与凝胶浓度（g）间的
2、线性关系，可表达为下列等式：Log g= log g0Kr g式中卩0为自由电泳迁移率;Kr为阻带系数，它是与凝胶性质、迁移分子大小及形状有关的 常数。因此，利用不同的凝胶浓度，就能在较大范围内分离不同大小的DNA片段。表 1、 琼脂糖的浓度对分离范围的影响凝胶中琼脂糖含量（）线性DNA分子的有效分离范围0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.2230.13）DNA分子的构象：分子量相同的闭合环状DNA（第一型）、有缺刻的环状DNA（第二型） 及线状DNA（第三型）在琼脂糖凝胶中的迁移率不同。4）电泳所用电流：低电压条件下线性DNA片段的迁移率与所用电压
3、成比例。随电场强度 的增加，高分子量DNA片段迁移率也有不同程度的增加，因此，电压增加时则琼脂糖凝胶 电泳分离DNA的有效范围减少。为了获得DNA片段的最佳分离效果，凝胶电泳的电压应 小于 5 V/cm。在基因治疗研究中，常用到多种带正电荷的聚阳离子材料，如聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、壳聚 糖以及树枝状载体材料，它们能与质粒DNA在一定的重量比或摩尔比下，通过正负离子的 结合，缩合形成纳米微粒。在凝胶电泳实验中，通过不同重量比或者摩尔比的载体材料与 DNA 的结合，在外加电场的作用下，结合物在凝胶上迁移的距离有所不同。因此可据此筛 选材料与 DNA 完全结合时的重量比或者摩尔比，为载体材料在体外细胞
4、实验和体内实验提 供适宜的比例关系。在凝胶电泳实验中，常用的电解液是50 mmol pH 7.57.8的Tris 乙酸盐、硼酸盐或 磷酸盐等几种不同的电泳缓冲液（见表），通常配成浓缩液于室温贮存。表 2、常用缓冲液的配制缓冲液组成浓缩贮存液（每升）Tris 乙酸盐 (TAE)0.04 mol Tris-乙酸盐0.001 mol EDTA5 X： 243 g Tris 碱57.1 mL冰醋酸100 mL 0.5 mol EDTA(PH 8.0)Tris 磷酸盐(TPE)0.08 mol Tris-磷酸盐0.002 mol EDTA10X： 108 g Tris 碱15.5 ml 85%磷酸(1.
5、679 阿/ml)40 mL 0.5 mol EDTA(PH 8.0)Tris硼酸盐(TBE)0.089 mol Tris硼酸盐0.089 mol 硼酸0.002 mol EDTA5 X： 54 g Tris 碱27.5 g硼酸20 mL 0.5 mol EDTA(PH 8.0)而Tris-乙酸盐（TAE）是最常用的电解缓冲液。TEA的缓冲能力相当低，长时间电泳缓冲 系统容易失效（阳极变碱，阴极变酸），因此，在使用数次后需及时更换成新鲜的缓冲液。在琼脂糖凝胶电泳实验中，对DNA观察最方便的办法是用荧光染料溴化乙锭（Et hidium bromide EB）染料。EB具有可插入DNA碱基群中的一
6、个平面基团。这一基团的结合部分与 碱基很接近，使染料与 DNA 结合后较游离于液体中的染料表现出更强的荧光。溴化乙锭 （EB）可用于检测单链或双链核酸（DNA与RNA）,。通常在凝胶及电泳液中均掺有溴化乙锭 （0.5 Ag/ml）。一、实验目的1. 了解凝胶电泳的原理及基本操作。2. 掌握凝胶阻滞电泳分析材料与DNA的结合能力。二、实验原理实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳实验。在电场中，在pH值为8.0 8.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。阳离子聚合物是目前非病毒基因 载体中研究较多的一类材料，如聚乙稀亚胺EI)、聚氨基酸和壳聚糖等，与DNA的结合能 力对其转
7、染效率有着至关重要的影响。以PEI为例，其与DNA通过静电作用形成一个复合物 微粒，通过凝胶阻滞实验即可直观的反应其浓缩DNA的能力。在实验过程中，需计算聚乙烯亚胺与DNA的比例。从研究中发现，对聚乙烯亚胺的研究 较多的是采用纳摩尔比(nmol/nmol),即聚乙烯亚胺中所含“氮”的纳摩尔(nmol)： DNA中 “磷”的纳摩尔(nmol),也就是通常所表示的N/P比。以25KDa的聚乙烯亚胺为例，称取 90 mg的PEI溶于20ml的去离子水中，其浓度为4.5ug/ul，因为其分子量为25000，故其 浓度为0.18nmol/ul。由于聚乙烯亚胺中的基本单元结构为一CH2CH2NH2,CH2
8、CH2 NH和一CH2CH2N三种单元结构的质量分别为44, 43, 42平均为43,另外对于分子量 为25000的聚乙烯亚胺而言，共有个581个结构单元，即25000/43 = 581。所以聚乙烯亚胺 中的“N”含量为0.18X581 (nmol/ul)=100nmol/ul,也就意味着质量浓度为4.5 ug/ul 的聚乙烯亚胺(分子量为25000)，其“N”的浓度为100nmol/ul。其他分子量的聚乙烯亚胺 溶液可以按照以上的方法进行质量浓度与摩尔浓度的换算。对质粒DNA而言，根据其结构中 碱基对的数量，每微克的DNA含3nmol的磷，即“P”的浓度。这样，PEI与DNA的N/P即 为P
9、EI中所含“N”的nmol与DNA中所含的“P”的nmol之比。如聚乙烯亚胺储存液的浓度 为10 nmol/ul, DNA储存液的浓度为0.33 ug/儿(即 “P”的浓度为1nmol/ul)，在实验中 取PEI 和 DNA各1ul,则两者的N/P比即为10 nmol/1 nmol=10/1,当然在研究中可以调节 两者的浓度，使得N/P为整数倍，如1/1, 2/1, 3/1。也可以用聚阳离子材料与质粒DNA的重量比进行凝胶电泳实验，即微克载体材料比微克质粒 DNA。下图是阳离子材料聚乙烯亚胺/DNA复合物的凝胶电泳照片。DNA 0.2/1 0.4/1 0.6/1 0.8/1 1/1 2/1 3
10、/1 (nmol/nmol)图1阳离子材料聚乙烯亚胺/DNA复合物的凝胶电泳示意图三、仪器和试剂1. 聚乙稀亚胺25 kDa，琼脂糖，TAE, EB,质粒DNA,上样缓冲液。2. 培清JS-380A自动凝胶图像分析仪，Tanon EPS100核酸电泳仪。四、实验步骤1 聚乙烯亚胺溶液制备称取90 mg的PEI溶于20ml的去离子水中，其浓度为4.5ug/ul,因为其分子量为25000, 故其浓度为0.18 nmol/ul。2 琼脂糖凝胶的制备（大板）称取1g琼脂糖，加入1 OOmLTAE缓冲液（1X）,沸水浴或者微波加热至熔化，晃动使 之均匀，冷却至60 C后加入3 uL溴化乙锭（Ethidi
11、um bromide, EB）（0.5 ug/mL）,混匀 后灌胶并插好梳子，静置约30 min，使之凝固。拔掉梳子，将胶小心推入电泳槽，加样口 一端应与负极（黑色）平行。电泳槽中加入TAE缓冲液，使液面高于凝胶约1 mm。注：中板则取500 mg琼脂糖，小板则取250 mg琼脂糖，浓度与大板一致。3聚乙烯亚胺/DNA复合物的制备称取PEI25 kDa 90 mg，将其溶于20 mL水中得到母液，其含N浓度为100nmol/|jL。取 30 pL该母液稀释至1mL得到含N浓度为3 nmol/pL的PEI溶液。取DNA,稀释使其含P的 浓度为3 noml/pL。取上述PEI溶液和DNA溶液各1
12、pL,用PBS稀释至20uL，混匀得到N/P 比为1：1的溶液，静置30 min左右使其充分复合。然后将该样品与上样缓冲液混合均匀， 依次点入加样孔中。通过调整二者的加样体积，可以得到N/P为2, 3, 4的复合物。4电泳实验打开电泳仪，设置参数，电压80 v,电流800 mA，时间30 min左右，待看到上样缓冲 液指示剂到达阳极一端，停止电泳，在凝胶图像分析仪上拍照。五、注意事项：1. 溴化乙锭是很强的诱变剂，接触含有该染料的凝胶或溶液时一定要戴手套。2. 设计实验时，阳离子材料和DNA的N/P要选择合适，使得到的凝胶电泳照片能够有层次 的显示其与DNA的结合情况。3. 加样时要注意尽量不
13、要让样品溢出加样口，缓慢小心的加入。六 思考题1如何进行载体材料/DNA重量比与纳摩尔比的换算。2根据聚乙烯亚胺与质粒DNA中N/P的计算，如何计算聚赖氨酸和壳聚糖与DNA的N/P比例。七、参考文献：1.D Li,G Tang.et al. The construction of a novel kind of non-viral gene delivery vector based onprotein as core backbone. VOx Sanguinis 2008;94:234 241.2. Yun-Xia Sun,Ren-Xi Zhuo.et al.Synthesis of (Dex-HMDI)-g-PEIs as effective and low cytotoxic nonviral gene vectors. Journal of Controlled Release 2008;128:171-178.(赵丹军 汤谷平)
