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1、全血分离获得血清的方法及步骤材料与方法1.1血清采集MG患者全血来自20042005年就诊于辽宁中医学院附属医院的门诊患者。根据典型临床表现、新斯的明试验、低频重复电刺激及单纤维肌电图等确诊，无其他自身免疫性疾病，未经其他免疫抑制治疗，并参照1994年版中医病证诊断疗效标准辨证为脾肾虚型。正常人血清取自同时期健康志愿者。-70C冰箱冷冻保存备用。1.2主要试剂固相pH梯度干胶条IPGstrip(Amersham公司产品，非线性pH310，7cm)。3-3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基丙磺酸盐3-(3-cholamidopropyl)dimethylamino-1-propanesul-fonate
2、,CHAPS,二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol,DTT),三丁基膦(tributylphosphine,TBP),尿素，硫脲，碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA),丙烯酰胺(acrylamide)、甲双丙烯酰胺(N，N-methylenebi-sacrylamide)，四甲基乙二胺(N，N，N，N-tetram-ethyl-ethylenediamine,TEMED),过硫酰胺(am-moniumpersulfate,APS),三羟甲基氨基甲烷tris(hydroxymethyl)aminomethane、甘氨酸(glycine,Gly)和十二烷基磺酸钠(sodiumd
3、odecylsulfate,SDS)均为Bio-Rad公司产品。琼脂糖为华美生物公司产品。其他试剂均使用国产分析纯试剂。所有溶液均用MilliQ水配制。1.3主要仪器高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司产品;EttanTMIPGphorII,AmershamBiosci-ences公司产品;P-2000分光光度仪，Hitachi公司产品;SE-600电泳仪，Amersham公司产品;纯水装置，Millipore公司产品;GS-710光密度扫描仪，Bio-Rad公司产品;冷却水循环系统，Cole-Parmer公司产品;Bruker-DaltonicsAutoFlexTOF-TOFLIFTM
4、assSpectrometer,美国Bruker-Daltonics公司产品;LCQDecaXPPlus,美国ThermoFinnigan公司产品。1.4双向电泳1.4.1血清总蛋白质的提取及定量血清-70C反复冻融4次后，用AgilentMultipleAffinityRe-movalColumn处理去除高丰度蛋白。使用Agilent5K超滤管进行浓缩除盐，冻干回收的样品，-70C保存。用裂解液(9mol/L尿素、4%CHAPS、65mmol/LDTT和cocktail酶抑制剂)进行复溶并采用考马斯亮蓝法进行蛋白质定量。1.4.2等电聚焦自-20C取出的胶条，室温下平衡10min,以500聘
5、上样量在每份样本中加入上样缓冲液(8mol/L尿素、2%CHAPS、1%Bio-lyte和1%TBP)以及标准蛋白质分子,上样于泡胀槽中，加入矿物油覆盖。程序设置如下:30V12h，500V1h，1000V1h，8000V6ho恒温20Co等电聚焦电泳后IPG胶条在平衡液1(Tris-base50mol/L、尿素6mol/L、甘油30%、SDS2%、溴酚蓝0.002%和DTT100mg)中于振荡器上振荡15min;然后置入平衡液2(成分同平衡液1，用400mg碘乙酰胺代替100mgDTT)同样于振荡器上振荡15min。1.4.3SDS-PAGE垂直电泳采用12.5%的均匀SDS2聚丙烯酰胺凝胶
6、(水23.2ml,30%丙烯酰胺溶液32.46ml,1.5mol/LTris-HCl缓冲液pH8.820ml,10%SDS0.8ml,10%APS0.4ml,TEMED3.76gl,胶总体积80ml)。将平衡后的IPG胶条移至凝胶的上方，胶条一端放入低分子量蛋白质标准，0.5%的琼脂糖封胶。上下槽加入电极缓冲液(Tris5mmol/L,Gly192mmol/L和SDS0.1%)。初始电流为每块胶40mA,电泳20min,然后以每块胶60mA电流,直至溴酚蓝前沿。1.4.4银染色电泳结束后,采用硝酸银染色法,通过固定,硝酸银染色,显影,停显及脱色,至背景清晰。1.5图像分析每个样品常规进行3次二
7、维电泳，用GS-710光密度扫描仪对电泳后的胶图分别进行扫描，所得扫描图像输入计算机，采用Image-master软件对图像进行背景消减、蛋白质点检测和校正，获取蛋白质点的位置坐标和表达量等分析。选取Ratio1.5的蛋白质点认为有差异。所有数据的统计分析均采用SPSS12.0软件，统计学分析采用t检验。1.6基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析用手术刀片切下胶上目标条带，进行切胶、胶上胰蛋白酶酶解20h，抽提酶解肽段，ZipTip脱盐后点样，行基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(matrixassistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmass
8、spectrometry，MALDI-TOF-MS)分析(飞行管长2.7m，加速电压20kV，反射电压23kV)。将第1级质谱得到的肽片段质量指纹图谱、肽质量指纹图谱与第2级质谱得到的肽序列信息一起用来检索蛋白质数据库，找出匹配的蛋白质。1.7数据库检索将质谱鉴定所得的肽质量指纹谱(peptidemassfingerprinting，PMF)数据于Bio-Works(ThermoFinnigan，SanJose，CA)软件搜索相应的库。搜索使用的数据库为IPIhuman蛋白库(SEQUEST结果过滤参数为:当Charge+1，Xcorr1.9;当Charge+2，Xcorr2.2;当Charge+3，Xcorr3.75;其中DelCN0.1)以及NCBI上Homosapiens的非冗余蛋白库(redundantdata-base)。检索参数为胰蛋白酶解;氨基酸固定修饰方式为脲甲基半胱氨酸;模式为单同位素峰;肽片断最大误差控制在100ppm;肽片断最大分子量误差为0.5Da;每个肽允许有1个不完全裂解位点。2结果2.1脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱的建立及分析经2-DE技术及银染色后，得到了两组血清的双向凝胶电泳图，并于相同的条件下重复实验3次。在正常对照组细胞蛋白质组双向电泳图谱上可观察到1463179个蛋白点，而脾肾虚型重症肌无力组可见到150889个蛋白点
