《将RNA通过RT成cDNA以后再做实时荧光定量PCR的问题》由会员分享，可在线阅读，更多相关《将RNA通过RT成cDNA以后再做实时荧光定量PCR的问题（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Q：做反转录PCR时，提取的RNA该怎么用DNAase 1处理？A： DNAase I处理的目的是去除基因组DNA, PCR后不会有基因组DNA污染，扩出的 是没有n内含子的cDNA，从而降低做定量PCR的误差。我原先也想买DNAase处理我提取的RNA,但是听我们实验室的人说效果不好（我不知道 具体不好的原因），而且增大RNA降解的机会，所以我就没有处理，直接RT 了。接下去 就打算跨内含子设计引物做后续的荧光定量PCR （现在还没有做，呵呵）。我看见有人是这样处理的（不知到对你是否有用）：把酶加到TE溶液中（用RNase-Free的水配），先配成10mg/ml的母液后煮沸15min，冷 却
2、后放冰箱-20度保存，用时稀释50倍，100倍看你自己了，然后就是混合RNA，37度 处理三十分钟。你可以问试剂供应商要一张DNAase的试剂说明书，我想，如果是好的试 剂，里面都有说明说的，而且说得比较清楚。Q:现在已经提取出总RNA 了，需要做逆转录成cDNA，然后再做荧光定量PCR来观察基 因表达量的多少。在这个实验中逆转录时的引物可以直接用荧光定量PCR的引物吗？还是 有什么特殊的要求呢？A：如果是两步法做的话，反转录通常用的是随机引物或者oligoT,这样当然是无法用于PCR步骤的，需要重新选定基因特异性引物。为了避免RNA中有DNA染色体污染的的问题， 在反转录以前最后做DNase
3、处理，或者在设计PCR引物时，让上下游引物处于不同的外 显子上（跨越内含子）做逆转录时的基因特异引物只要扩出的条带无杂带，特异性强，扩增产物长度在150-300bp 之内就可以用于荧光定量PCR。Q： 1“随机引物”是什么意思，自己如何设计呢？2. “oligoT”是不是指一段TTTTTTTTTTTTT的引物，如果是，要多长，几个T呢？3. 逆转录出的cDNA要用于后续的实时荧光定量PCR，“随机引物”和“OligoT”各自的优缺点 都是什么？4“在反转录以前最后做DNase处理”，具体是怎么做的？说得详细一点，呵呵5.让上下游引物处于不同的外显子上（跨越内含子），这样做的目的是什么？-16我
4、看见园子里有人说要用“TE”调零和稀释RNA,但是我在用紫外分光光度计测定RNA浓 度时，直接用DEPC处理过的水调零和稀释RNA的。我这样做可以吗？ “TE”具体是指什么 呢？A：如果你只检测一个指标，可以用特异性引物，这样就可以避免RT-PCR过程中不同基 因转录效率不一致所造成的误差。但是如果你要检测几个样本，你可以用oligo dT或random hexamer，不需要自己买，RT-PCR试剂盒内有。前一段时间bio-rad工程师做Presentation 时说：现在文献内做 realtime PCR 的用特异性引物、oligo dT 和 random hexamer 各占 30%，剩
5、下 10%用 oligo dT+random hexamer。如果你的引物靠近5端，且mRNA超过3000bp，最好用random hexamer,否则都可以。DNase 一般的RNA提取试剂盒内会有。转成cDNA后常规PCR检测RT是否成功，primer是否特异，退火温度然后用一个样本2-10倍倍比稀释做realtime PCR，测定每对引物的efficiency。然后检测样本，采用公式计算Ratio。现在paffle （可能拼错了）的公式比较流行。如上所言，随机引物和oligoT都是商品化的，可以倒产品目录上看到相关信息。oligo T只能对具有ployA的mRNA进行反转录，它和随机引物
6、的应用在分子克隆上有论述。 DNase处理是防止提取RNA的过程中基因组DNA污染造成PCR中假阳性而采取的手段，如果 是用Qiaogen的试剂盒提取RNA，参照其说明书进行；如果是用TRIZOL提前，在正常提取 完成后，将溶解好的RNA样品按照DNase的说明书进行操作。跨越内含子的设计目的同上，如果引物设计在同一个外显子上，有cDNA和污染的基因组为 模版获得的PCR产物无法区分，如果引物设计在不同外显子上，以cDNA为模版扩增的目的 产物比较小（因为mRNA 上内含子被切除了），且扩增效率较高，而以污染的基因组DNA为 模版的 PCR 获得的产物要大一些（因为包括内含子序列），扩增效率会
7、低，甚至扩增不出 来。据说 TE 在紫外上信号相对稳定，其配方见分子克隆。Q：我是按照两步法做逆转率荧光定量PCR。现在已经买到RT试剂盒了，马上要开始做逆 转录这一步。试剂盒的东西还是很全的，里面有三种引物：oligo T，随机引物，对照引物。 我的样本RNA是用Trizol提的，是不是在逆转录以前必须要用DNA酶处理所提的RNA？ 我听有人说，可能是DNA酶本身的因素，用DNA酶处理RNA也会引起RNA降解的危险。如果我用Trizol提出RNA,不做DNA酶处理这一步骤，而是直接逆转录，然后设计跨越内 含子的PCR引物进行荧光定量PCR。这样的做法可取吗？A：我们试验室也不做dna酶处理这
8、一步，直接反转录，可以将荧光定量的引物设在两个外 显子上，这样就会避免有dna的污染产生杂带，还有更可靠的是将上下游都引物设在外显 子的交接处，但是很少有序列能这样设出来。Q：听说做荧光定量PCR用到的材料和普通PCR的差不多，只是多了染料，是这样吗？还有，就RNA的质和量而言，做荧光定量PCR比做普通PCR要求更高吗？具体高在那些 地方呢？我这几天也从组织提了 RNA,然后做了 RT。我对RNA和RT的产物都做了电泳，但是不 知道自己的实验结果好不好，麻烦大家帮我看看存在什么问题。下面是RNA电泳图片： 下面这张是RT产物的电泳图片：A： 1）取决于定量PCR的方法，如果用SYBR GREE
9、N，基本上来说就是只是多了荧光燃 料而已，如果是用Taqman等方法，那么就是要又标记了荧光的探针。2）PCR产物大小一般是有差异的，普通RT各种大小都有，不过我们通常不想片断太小， 以免跑胶不变，在做定量的时候，为了扩增效率的问题，一般产物大小在lOObp上下。3）我不认为对RNA的质和量的要求其实不是取决于技术，而是取决于实验目的。通常情 况下，普通PCR你只想知道阴性和阳性，所有RNA质量差一点无妨，质量不好的RNA定 量PCR也能出来，但是结果就不可靠了；灵敏度而言，定量PCR应该更高，要求的RNA 量应该不比普通的高。4）RNA看来是有一点降解，但还是不错的；我没RT以后跑过胶。Q：
10、我问过我们这里做实验的好多人，他们也都不对RT产物电泳的，RT以后就直接PCR了。有些问题想请教大家：1、如果对RT产物进行电泳，理论上电泳图会是什么样的呢？2、有人建议我再做实时荧定量PCR之前先做普通PCR来摸索体系的条件。还有人告诉我 说，做荧光定量PCR的引物和普通PCR的引物都不一样，如果是这样，实时荧光定量PCR 体系的条件和普通PCR的还能一样吗？应该是不相干的了。3、我后续的实验是做荧光定量PCR，染料法或探针法应该如何选择？各有什么优缺点呢（经济、效能、准确、简便等方面)？A：是基本不相关了，特别是使用探针的定量PCR,通常把PCR产物控制在lOObp左右了， 而用sybrg
11、reen 般也控制在200bp上下.探针法比较昂贵，探针设计有技巧，但是它的特异性高。sybrgreen便宜，通用性好，但是对PRC的引物和条件要求很苛刻，因为任何合成的核酸 都会被参与定量，因此特别是引物二聚体，对此方法影响很显著。RNA 质量不是很好， sear 非常明显。如果一个标本测多个基因，建议用Oligo dT逆转，然后再分别realtime PCR!如果mRNA核苷酸数过大，设计引物最好靠近3端。还有正如版主说的跨越外显子设计引 物。我用过 fermentas 的逆转试剂盒， 3000 多 bp 都没问题！1,如果使用Random Primer或者Oligo d(T)进行RT,产物应该是从几百到几千的smear。2，如果是使用2步法进行RT-PCR，引物有3种选择，除了之前说的Random Primer和 oligo d(T),还有就是GSP(gene special primer),如果使用GSP，前后可以使用一样的引物， 但是主要你参考一下QPCR探针设计的要求。3，taqman的试剂相对来说比较贵，但是准确度比较高。sybr green有点是比较便宜，方 便。缺点是特异性不是特别高。
