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1、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离LDH同工酶一、实验目的1. 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。2. 学习聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法分离LDH同工酶。二、实验原理LDH 同工酶是由催化反应相同、分子结构和理化性质不同的一组酶组成， 由于分子效应和电荷效应，他们分别以不同的速度在以聚丙烯酰胺凝胶 为支持物的电泳中泳动，可分离出 5 种同工酶，泳动速度为 LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5。聚丙烯酰胺凝胶电泳有丙烯酰胺单体和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在 催化剂作用下，形成的三维网状结构称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称 PAGE），电泳速度与粒子所带电荷、粒子大小有关外，还与网络的孔径 有关。粒
2、子大于凝胶孔径的，电泳速度慢。反之则电泳速度快。三、实验试剂30 %凝胶贮存液：丙烯酰胺29g，亚甲双丙烯酰胺1g，加蒸馏水溶至 100ml,过滤棕色瓶4度保存。Tris-甘氨酸电极缓冲液（5X） : Tris碱15.1g甘氨酸94g溶解于 900ml去离子水中调解为PH8.3用去离子水定容至1000ml。10%过硫酸铵：将0.5g过硫酸铵溶解于5ml水中。Tris-Hcl 1.5molml（ PH8.8）： 18.165g Tris 碱溶解于 40ml 水中， 用1mol/lHCl调节PH至8.8，加水定容至100ml。Tris-Hcl 0.5molml（ PH6.8）： 12.11g Tr
3、is 碱溶解于 40ml 水中， 用1mol/lHCl调节PH至6.8，加水定容至100ml。2X样品缓冲液：Tris碱0.76g蔗糖20g加41.5ml水溶解，然后加蒸馏 水定容至 50ml。染色液：甲醇250ml冰乙酸50ml考马斯亮R250 0.5g去离子水200ml.脱色液：甲醇250ml 冰乙酸80ml去离子水200ml。TEMED (四甲基乙二胺)四、实验操作1 PAGE 凝胶的制备12%分离胶配方成分体积/ml30%凝胶贮存液1.32Tris-Hcl 1.5mol / ml ( PH8.8)110%过硫酸铵0.04水1.6TEMED0.002(1) 一旦加入TEMED，混匀后立即
4、将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中,大约注入玻璃板的 2/3 轻轻在其顶层加入少量去离子水以磨平胶面。2) 聚合完成后倒掉凝胶上层的水，用滤纸吸干凝胶顶层残留水分。5%浓缩胶配方成分体积/ml30%凝胶贮存液0.335Tris-Hcl 1.0mol / ml ( PH6.8)0.2510%过硫酸铵0.02水1.35TEMED0.0013) 将浓缩胶注入分离胶上层，插入梳子，垂直放入室温下。4) 浓缩胶聚合后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内加入电极缓冲液。5) 取组织匀浆上清液加等体积的 2X 样品缓冲液混匀， 然后3000r/min 离心 5min 取上清液上样。(上样量为 20ul)6) 安装好电泳槽，将电泳槽与电泳仪正确连接 ，插入电源。(7) 开始电流控制在15-20mA，待样品到达分离胶之后电流升到 30- 45mA,3-4h 后停止。(8) 取下凝胶置于染色液中染色3-4h或过夜。9） 回收染色液加入脱色液脱色直至可看清楚条带为止。五 注意事项（1）操作时应带口罩，丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺家均有毒（2）电极缓冲液使用时要稀释 5 倍，过硫酸铵要现用现配。（3）玻璃板一定要洗干净避免凝胶面部平整。（4）凝胶制备时 TEMED 要最后加，插入梳子时应避免有气泡。（5）加样时要小心避免样品溢出污染其他泳道。
