细胞培养基的生产和过程控制

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1、细胞培养基的生产和过程控制细胞培养基作为生物制品生产的重要原材料之一，其质量对生 物制 品有重要的影响。细胞培养基的生产工艺和细胞培养基的原材 料选用、 生产过程及检验过程中的质量控制对于细胞培养基的产品 质量具有直接 影响。其中原材料的成份及其质量直接决定了细胞培 养基产品的质量及 安全性，选择合适的物料是实现细胞培养基功能 过程中需要解决的基础 问题。生产工艺的选择（如原料的研碎、混 合技术等）及生产过程中的 质量控制等直接影响产品的溶解性、批 生产量及批次间差异，进而影响 产品的质量。CGMP 稽查员在对国内细胞培养基生产企业进行 cGMF 审计时指出，细胞培养基的生产工艺及设备应经过验

2、证，原材料必须做鉴别 试 验，记录应真实反映生产过程的实际情况，生产过程偏差处理应 包括对 出现偏差之前涉及到的批次均应进行调查等等。这些要求是 基于FDA对 生物制药用原料的质量要求方面提出，远远高于国内对 药用原料的要 求。随着对人用和动物保健用生物制品安全性要求的 提高，严格执行 GMF 规范进行细胞培养基生产是国内细胞培养基行 业发展的必然趋势。 1.1 细胞培养基的原料选择及质量控制1.1.2 原材料的原料选择由于动物细胞培养基产品属于药用原料， 哺乳类动物细胞培养 基行业标准对细胞培养基产品的微生物限度、内毒素含量进行了 限 定，所以细胞培养基所用原料宜采用注射级、药用级原料。对于

3、 部份没 有注射级和药用级的原料，细胞培养基制造者针对自身产品 质量要求， 制定一些重要指标（微生物限度、内毒素、重金属等） 进行原材料的质 量控制。1.1.2 原材料的质量控制细胞培养基生产企业建立完善的原材料质量标准，对于原材料 的来 源、检验、使用、及销毁等有明确的可追溯记录。在质量控制 过程中， 药用级原材料的质量标准应参考中国药典相关标准，对于 非药用级原材 料应根据生产工艺需要与供应商一起共同确定质量标 准，质量标准应包 括如下内容：指定的物料名称和企业内部使用的 物料代码、药典专论的 名称（如有） 、 经批准的供应商以及原始生 产商、印刷包装材料的样 张、物料质量标准依据及其编号

4、、取样、 检验方法或相关规程编号、定 性和定量的限度要求、贮存条件和注 意事项、复验前的最长贮存期。原材料的质量检测主要从材料、人员、方法三个方面进行控 制：1）具有必要的检测试剂、设备和设施，如鲎试剂、分析天平、 洁 净操作室或取样柜。2）拥有相应操作资质和能力的检验人员，如相应检测人员应具 备 化验员资质并经过全面的技能培训。选择具有法律效力的检测方法以及对应的操作规范，在检测方 法的 选择方面药用原料应优先采用药典方法，非药用原料应采用经 过验证有 效的检测方法，在确定检测方法后应制定相应标准操作文 件，用于规范 试验操作。应严格控制细胞培养基的原材料质量管理，并建立相应完善的 原材 料

5、质量管理文件体系。原材料的质量管理方面，应明确规定责 任范围和 流程方法，它们是保证原材料质量的基础。原材料质量管 理文件体系内 容通常包括两个方面，一方面是明确原材料质量责任 应归属的部门及人 员，以实现分工明确；另一方面是明确原材料的 取样、检验、放行、判 定不合格、异常情况、偏差、验证等事务具 体流程，确保流程正确，方 法无误，为质量控制提供依据。1.2 细胞培养基生产生产工艺传统的细胞培养基生产工艺即生产过程通常分为物料配比、物 料干 燥、物料研碎、物料混合、物料包装、成品的检验等 6 个阶 段，下面 结合过程中的质量控制对此工艺进行介绍： 1.2.1 物料配比物料配比是根据配方要求将

6、各种原料按比例配制的过程。配制 需严 格执行配方，才能保证细胞培养基产品功能的实现及降低批间 差，而实 现低误差的物料配比过程需从以下几个方面进行控制：1) 提供与生产工艺规程匹配且经过审核的、有效力的物料配方， 生 产部门根据配方制定配比操作记录，经质量管理部门审核后，方 可投入 生产作业使用；2) 具有详细明确的经过验证的设备、设施、工序操作规程以及相 关 管理规程，如通过编制设备、设施的验证、使用、维护、维修操 作规程来明确操作方法和流程，通过编制相应管理文件，来明确人 员责任；3) 具有足够的在校验有效期内的精确度合理的计量器具，及与产 品质量要求相匹配的生产环境设施，如为降低细胞培养

7、基微生物、 内毒素 限度使用洁净厂房进行生产等；4）足够的经过合理培训具有上岗资质的操作人员和设备管理人员 （操 作员上岗证、计量员证） ，各岗位操作人员配备足够，能够确保 操作过 程实现双人操作双人复核；5）配备足够的基层管理人员以及现场QA起到指导和监督作用。1.2.2物料干燥基于细胞培养基产品营养丰富，且不是无菌制剂的特性，为避 免微 生物滋生破坏细胞培养基成份，需控制细胞培养基中的水分含 量，依据 行业标准要求，其干燥减重质量分数应低于5.0%，而原料干燥是控制其含水量的最重要环节。目前常用的干燥方法有常压干燥和冷冻干燥。常压干燥包括烘 干干 燥、鼓式干燥、带式干燥，由于国内细胞培养基

8、生产厂家普遍 采用球磨 缸进行生产，由于各缸独立，无法使用鼓式干燥、带式干 燥的方式进行 连续烘干作业，所以普遍采用烘干干燥的方式按批进 行物料干燥。冷冻 干燥主要用于不能耐受高温的贵细物料的干燥处 理。1.2.3物料研磨细胞培养基颗粒越细，同质条件下比表面积越大，其溶解性越 好， 而其成品细度是由物料的研磨过程直接决定。对于物料的研 磨，传统普 遍采用药用球磨机，其主要优点是结构简单、操作方 便、易于清洁及使 物料混合作用（能够实现缸体内各种成份的均匀 分布）。球磨缸内的研磨球材质通常有陶瓷玛瑙不锈钢（304或316L）。但是球磨机也存在批量小、噪音大、难以控制温度、粉状物料不易取出且取料过

9、程会产生大量粉尘等缺点。目前国内一些细胞培养基生产企业在球磨缸取料 工序装备了全密闭自动取粉装置，较好的解决了粉尘污染问题，也进一 步降低了由于物料的裸露可能带来的引入异物及物料受潮的风险。1.2.4物料混合混合设备首先必须具备能够实现物料均匀性的功能。在上述物料研 磨过程中，可能存在投料微量误差过程参数细微差异以及其他不可控 因素，上述因素的累积会导致不同研磨单元内物料可能出现一定的差异 （外观理化性质培养性能） ，这些差异将直接影响产品的使用， 造成使用者生产效率及产品的批间差异。根据哺乳类细胞培养基行业标 准中对于“批”的定义，即同一台混合设备一次混合量所生产的均质产 品为一批，物料经研

10、磨单元研磨以后必须进行总混和均匀后才能称为一 批成品进行包装。目前常用的物料混合设备以掺和机双锥混合机较为 常见。1 .2.5物料包装物料的包装分为内包装和外包装，主要为了实现如下功能：1 ）阻隔性功能：即密闭保存（避光防潮防污染防氧化等） ，是 指直接与产品接触的内包装，在选择内包装材料时其阻隔性是关键，高阻隔性包装薄膜所采用的阻隔性树脂主要有EVOH、PA、PET PVDC PGMXD侨口聚丙烯腈共聚物，其中PVDC是开发较早的阻隔性能优异的材料，而包装用薄膜材料结构包括：纸塑料塑料镀铝塑料纸铝 箔塑料和塑料铝箔塑料等几种【 11】；2) 产品信息的提供：产品外包装上应明确标识品名、批号、

11、代码、 生产日期、有效期、使用方法等基础信息，并随附企业质量监管部门下 发的产品合格证以及质量检验报告等质量证明文件；3) 易于运输的防护：确保外包装物能够抵御运输过程中装卸产生撞 击的冲击，并要具备一定的堆叠强度，对于需要远途运输的不能耐受高 温的成品应做好低温保护工作(填充保温材料，包装箱内混装冰袋、干 冰等蓄冷物) 。1.2.6成品的检验细胞培养基产品生产完毕后，由质量检测部门对该批 次产品进行检测，在这一周期内，成品处于待验状态，储存条件应与合 格成品一致，应专区存放专人管理，避免混淆和遗漏，在收到质量检测 部门检测合格予以放行的通知后，转交成品库，移入合格品区备售。1.2.7细胞培养

12、基生产的新工艺采用上述传统的生产工艺(通常称作球 磨工艺)生产的产品均一性较好，物化性能稳定以及细胞培养效果较好，但是存在批量小、研 磨过程中的散热难以控制、噪音及粉尘污染较大等缺点。2005年新开发了一种连续生产的针式研磨系统( pin mill )，集“物料 混合针式研磨研磨后混合”一体，用于工业化生产干粉细胞培养基，可以用来生产从10kg至4000kg不等批量的干粉细胞 培养基。Pin mill研磨系统是一种高速冲击研磨系统，包括一个进料口 两个同轴带有研磨针的转盘以及一个出料口。当原料通过进料口投入研 磨器后到达转盘中央，在转盘旋转离心力的推动下往径向外侧运动同时 被相互咬合且相对旋转

13、运动的研磨针研细。物料在进入针式研磨腔前和 完成研磨离开研磨设备后都使用混合机进行了混合，以确保进入研磨器 和最终产品的成份均匀性，其生产工艺流程见下图4-1 。与传统的球磨生产工艺相比，Pin mill生产系统研磨的颗粒更 细，批次控制范围大且灵活(0.54000kg),在研磨及研磨后颗粒输 送的 过程中，采用氮气控制机体的温度，使研磨机的温度保持在40c以下， 并且避免了粉尘污染、交叉污染等。该系统机体的拆分、组装及清洁也 较为简单，适合cGMPfe产。关于使用pin mill系统生产的DPM性能，如生产过程中的成 份组成均质性、生产的产品性能及是否适合细胞培养和生物制品生产 等，有详细的

14、验证研究，结果显示，pin mill生产工艺生产的产 品均 匀分布性满足标准，并且均匀性与成份以及批量大小无关；生产的产品 诸如溶解性 pH渗透压等理化性质、细胞培养方面及生物制品生产与球 磨生产工艺相同2细胞培养基的质量标准和检测方法 2.1哺乳类动物细胞培养基行业标准介绍国内细胞培养基使用者一般采用经验法或实验法选择培养基，但是 这些经验或是来自于以前的传统方法或是通过简单的细胞培养实验， 因其影响因素较多，在判定的过程中，不同的使用者判定的标准也不相 同，进而可能影响对产品的正确选择。因此，采用统一的质量管理规范 是控制产品质量的一个基本前提，2007年10月1日国家发展和改革委员会批准

15、的哺乳类动物细胞培养基(HG/T3935-2007)国家化工行业标准正式实施，为国内动物细胞培养基产品质量及检测方法提供了统一的标准，该标准对哺乳类动 物细胞培养基的检测项目和方法做出了明确的规定。2.2细胞培养基的检测方法2.2.1澄清度检查法该方法依据中国药典2010版二部附录IX B澄清度检查法制 定。澄清度是检查药品溶液的浑浊程度，即浊度，药品溶液中如存在细微颗 粒，当直射光通过溶液时，可产生光散射和光吸收的现象，致使溶液微 显浑浊，所以澄清度可在一定程度上反映药品的质量和生产工艺水平。水是培养基的溶剂，细胞培养基中的营养成份只有完全溶解于水才能被 细胞吸收摄取，细胞才能生长增殖，因此

16、培养基是否溶解以及培养液是 否透明澄清直接影响培养基使用。通过对水溶解后的培养基的澄清度检 查，判断细胞培养基的溶解性。此法是用规定级号的浊度标准溶液与供 试品溶液比较，以判定细胞培养液的澄清度或其浑浊程度。2.2.2 pH值测定法各种细胞的正常功能及一切生物化学反应，都是在 适当和稳定的酸碱环境下进行的，因此细胞培养基的pH值是细胞生长 的重要参数，pH值偏低或偏高都会影响细胞生长。该法依据中国药典2010年版二部附录w H pH值的测定法进行。由于各酸度计的精度与操作方 法有所不同，应严格按各仪器说明书与注意事项进行操作，并在使用之 前注意校正。在工业化使用时，由于传统的细胞培养基中含有pH指示剂如酚红等，通常依据“眼睛”观察培养液颜色来判定pH,或是简单的使用