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1、【S】(rIH疫苗生产用细胞基质的技术审评一般原则药品审评中心二00五年十二月目录一、概述3二、细胞基质的分类4三、细胞基质存在的潜在危险性6四、细胞基质的一般技术要求和评价8五、 新细胞系/株的技术要求13六、参考文献14七、起草说明15八、著者17、概述生产用细胞基质是指培育病毒时所需要的细胞，是生产病毒疫苗 必不可少的原材料。任何微生物的生长、繁衍都有各自的最大体的条 件，病毒的生长和繁衍必需在细胞内进行。病毒疫苗是以培育、收获 足够量的病毒为基础。目前培育病毒的方式主要有二种，一种是通过 病毒的细胞培育取得病毒，另一种是采用病毒感染动物（包括鸡胚） 获抱病毒。生物制品的质量控制不单单是
2、对终产品的质量控制，而是对整个 生产进程的质量控制，包括原材料、中间产品、终产品和生产进程的 质控等等。细胞基质作为主要原材料，其质量的好坏，直接影响疫苗 的质量和产量，尤其是疫苗的安全性。一般以为，用细胞基质生产疫 苗，主要关注的质量问题在于可能存在的外源因子污染和某些情况下 细胞本身的特性，和细胞培育中各个环节的操作，因此，只有妥帖解 决上述问题，才能达到对疫苗的质量控制。本原则主要论述细胞基质的分类、各类细胞基质的优缺点、力求 从科学的角度分析和熟悉潜在的危险性，和科学客观评价细胞基质安 全性和有效性常常利用的方式等等。本原则仅为一般性技术要求和原 则，非强制性。希望能够有助于疫苗类制品
3、的审评工作，同时增进药 品审评机构与疫苗生产企业、疫苗研制者之间的交流。另外，希望本原则对疫苗研制开发工作有所启迪二、细胞基质的分类本原则将细胞基质分为三类，即原代细胞、二倍体细胞和传代细 胞。（一）、原代细胞 原代细胞是指直接来源于动物组织的细胞，动物组织经胰酶消化 培育成单层细胞（通常贴壁生长），用于病毒的培育。如地鼠肾细胞、 猴肾细胞、兔肾细胞、鸡胚细胞等。原代细胞在疫苗的生产中已利用 了40连年，证明是安全有效的。我国已上市的疫苗中，乙型脑炎疫苗、 肾综合征出血热疫苗、狂犬病疫苗利用地鼠肾细胞，麻疹、腮腺炎疫 苗利用鸡胚细胞，风疹疫苗利用兔肾细胞，脊髓灰质炎疫苗利用猴肾 细胞。原代细胞
4、具有的长处有：利用的细胞培育液相对简单， 很多 病毒都可以在原代细胞上生长繁衍，具有普遍的敏感性；原代细胞的 来源比较容易，尤其是地鼠，是哺乳动物中繁衍最快的动物之一；由 于原代细胞属正常细胞，没有DNA突变，无致肿瘤性。原代细胞的 缺点包括：存在潜在的病毒等外源因子污染问题；来自不同个体动物 的细胞质量和敏感性有不同。鉴于原代细胞的上述缺点，生产减毒活 疫苗的动物应尽可能达到SPF级，至少不该低于清洁级；生产灭活疫 苗的动物应尽可能达到清洁级以上，至少应采用健康动物；采用等级 动物的原代细胞或传代细胞和二倍体细胞是未来生产灭活疫苗的发 展方向。二）、传代细胞传代细胞是可在体外持续传代的细胞系
5、，理论上具有无穷传代的 寿命。传代细胞系可以通过以下方式衍生而来，（1）人或动物肿瘤细 胞的原代细胞的系列培育，例如Hela细胞、Namalva细胞等；携 带致癌基因的病毒，将致癌基因转化给正常细胞，成为肿瘤细胞，例 如EB病毒转化的B淋巴细胞； 骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，例 如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞株；（4）正常细胞群的持续传代，繁 衍成一个新的具有无穷寿命的细胞群，例如非洲绿猴肾细胞的传代细 胞系Vero细胞、幼仔地鼠肾的传代细胞系BHK21细胞、中华仓鼠卵巢 细胞的传代细胞系（CHO细胞）等。目前尚无用于疫苗生产的来源 于人类组织的传代细胞系。由于肿瘤细胞或携带肿瘤基因的细胞具有致
6、肿瘤的危险，所以该 类细胞不能作为细胞基质用于疫苗生产；因此用于病毒组织培育的细 胞系采用非肿瘤细胞系，即正常细胞群的持续传代后繁衍的细胞系， 在必然传代限度内利用，利用最多的是Vero细胞。例如，人用狂犬病 纯化疫苗、脊髓灰质炎灭活（纯化）、肾综合征出血热纯化疫苗、乙 型脑炎纯化疫苗均已利用Vero细胞生产。传代细胞具有的长处包括：能够充分鉴定和标准化； 利用细胞 种子库系统生产，有利于质量控制；可用于微载体生物反映器，可大 规模生产； 对培育基及牛血清的营养成份要求不高。传代细胞的缺 点有，理论上有致肿瘤性的危险，但WH O以为Ver o细胞在150代之内 利用是安全的，无致肿瘤性。（三）
7、、人二倍体细胞人二倍体细胞是采用人源细胞（一般为胚胎组织）成立的细胞株， 可进行体别传代培育，但具有必然的传代寿命，超过必然代次，细胞 衰老，女如2BS细胞、IKMB-17、MRC-5细胞等。上述细胞系在疫苗的生 产中利用了30连年，证明是安全有效的，无致肿瘤性。我国已上市的 疫苗中，甲型肝炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗、风疹减毒活疫苗、水痘减 毒活疫苗别离利用了2BS、IKMB-17、MRC-5细胞。二倍体细胞与原代 细胞相较，具有能够充分鉴定和标准化的长处，可实现细胞种子库系 统，成立的细胞库可连年用于生产，有利于质量控制。二倍体细胞与 传代细胞相较，理论上不存在致肿瘤的潜在危险性。二倍体细胞存在
8、 的缺点是，与传代细胞相较，难于大规模生产；对培育液及牛血清的 营养成份要求较高。三、细胞基质存在的潜在危险性 动物细胞用于疫苗生产，应考虑其带来的潜在危险。重点考虑病 毒与其他可传播因子、细胞DNA和促生长蛋白等。（一）、携带潜在病毒和其他可传播因子 细胞系/株本身有可能携带内源性病毒和外界污染的病毒。若是 细胞基质被病毒污染，则生产出来的疫苗也会含有污染的病毒，直接 影响疫苗的安全性；尤其是减毒活疫苗，由于没有灭活工艺，内源性 或外源性病毒的污染可能会致使严重的后果。人类或灵长目动物细胞系可能携带潜在的病毒，例如乙型肝炎病 毒、逆转录病毒等；还有可能含有整合在细胞DNA上的病毒基因。虽然人
9、二倍体细胞用于疫苗生产30连年，未见有病毒性污染的报导， 但仍不能完全排除人类病毒潜在污染的风险禽类组织细胞隐藏着外源和内源性逆转录病毒，但目前没有证 据表明这些细胞基质生产的疫苗可向人类传播疾病。例如连年前利用 含有禽白血病病毒的鸡胚生产的黄热病疫苗、麻疹疫苗、流感疫苗。 虽然如此，仍应防范禽类外源和内源性逆转录病毒给人类可能带来的 危害。啮齿类动物细胞隐藏着外源和内源性逆转录病毒及其他病毒，可 能携带淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、出血热病毒等，其可以直接感染 人类而致病。（二）、细胞DNA连年来，原代细胞和二倍体细胞已成功、安全地用于多种疫苗生 产，已以为这类细胞的残余DNA无危险性。由于传代
10、细胞调控生长 的基因失调，使得传代细胞系具有无穷的寿命。因此，理论上以为传 代细胞系的DNA具有使其他细胞生长失控和产生致肿瘤活性的潜在 能力。人类对传代细胞DNA的危险性有一个慢慢熟悉的进程。1986年 WHO按照动物致癌基因模型提出危险性评估，在体内暴露1ng的细胞 DNA （该基因组中含有1个活化致癌基因的100个拷贝），可引发1/109 个受体发生转化。并以为疫苗中含有W100pg/剂量的细胞DNA的危险 性可忽略不计。在肯定此界限时，考虑的不是DNA本身，而是编码 活化致癌基因的特殊DNA序列减少到最少。细胞DNA可致使瘤变的嵌入突变的危险性极小。有报告结果显 示，通过嵌入诱变证明，
11、10u gDNA可致使1/107个受体的一个细胞的2 个独立的肿瘤抑制基因失活。1998年发表的文章表明，含有活化基因的mg级DNA注射灵长类 动物，10年内未引发肿瘤。目前以为，传代细胞系的DNA是一种细胞污染，而不是一种需 要降低到极低水平的严重危险因素，但鉴于疫苗的利用者为健康人 群，而且采用传代细胞生产的灭活疫苗逐渐增多，因此应尽可能降低 疫苗中残余DNA含量，最大限度地降低潜在的危险。生产工艺中必 需有去除DNA的工艺，并进行工艺验证。另外，卩-丙内酯既可以灭 活病毒，也可以降解核酸。口服制剂的残余DNA含量的危险性可忽 略不计。（三）、促生长蛋白及细胞残留蛋白传代细胞可分泌生长因子
12、（称促生长蛋白），该生长因子可以增 进细胞生长，但作用一般是短暂的、可逆的，危险性有限。它们不能 复制，而且大部份在体内迅速失活。在异样情况下有致肿瘤作用，但 需要持续作用。一般以为，疫苗中含有微量的已知的促生长蛋白不组 成严重危险，但仍需关注其带来的潜在危险。同时，疫苗当中的细胞 残留蛋白属异源蛋白，有可能引发机体的过敏反映。因此，利用传代 细胞生产的疫苗，应进行纯化，尽可能去除细胞蛋白，而且要进行纯 化工艺的验证。鉴于目前尚无特异性传代细胞蛋白（包括促生长蛋白） 的检测手腕，现仍以疫苗蛋白总量进行间接质控。目前，我国部份生 产企业的工艺可将个别疫苗蛋白总量降至10 ug/剂量以下，其细胞蛋
13、白残留量相对较少。四、细胞基质的一般技术要求本节所论述的细胞基质的一般技术要求和评价，是针对国内外已 研究成功并连年用于疫苗生产的细胞系/株，企业利用或引进该细胞 系/株时，需要重点考虑的问题和需要进行验证性工作。不适用于新 的细胞系。（一）、辨别实验一般针对细胞的特点设计实验方式，以肯定该细胞的正确性。一 般可采用12种方式，例如可采用核型分析，生物化学法（犹如功酶 分析），免疫学方式，细胞遗传学实验（如染色体标记），基因标记实 验（如DNA图谱）等。二）、细胞基质对病毒的敏感性：细胞培育的目的是取得足够量的病毒，若是病毒不能在细胞上很 好地适应和复制，就失去了细胞培育的目的；达不到规模化生
14、产的能力，产品研制开发的前景不容乐观。因此，选择适宜的细胞基质是疫 苗研制的基础。一般选择有充沛来源的、对研发的目的病毒敏感的、 能够大规模生产的、可以进行质量控制的细胞基质。有些病毒对一些 细胞基质不够敏感，但可以通过在该细胞基质上适应传代的方式，使病毒慢慢适应该细胞基质，最终在必然的代次后达到必然的滴度，知 足生产疫苗的需求。由于每种病毒感染细胞的滴度不同，每种疫苗所 需要的病毒量（免疫原）也不同，所以目前对于疫苗毒种的滴度要求 没有统一的尺度，不同的疫苗有不同的标准。例如目前已上市的疫苗中，麻疹减毒活疫苗毒株的滴度要求为ml,乙型脑炎减毒活疫苗毒 株的滴度要求为mlo因此,对细胞基质敏感
15、性的评价不单单是结果， 一样重要的是病毒在细胞基质上适应的全进程。细胞基质的敏感性直 接影响疫苗的产量，只有达到规模化生产，才有生产疫苗的可能，才 能起到预防传染性疾病的作用。另外，应重点考虑在细胞培育中，接 种尽可能少的病毒量，收获尽可能多的病毒量。（三）、外源因子 一个合格的细胞系/株应无任何外源因子污染，所谓外源因子是 指除细胞之外污染的细菌、真菌、支原体、病毒（包括细胞系/株本 身携带的病毒和外界污染的病毒）。若是细胞基质被外源因子污染， 则生产出来的疫苗也会含有被污染的外源因子，直接影响疫苗的安全 性；另一方面，疫苗生产的目的病毒会被外源因子干扰，可严重影响 疫苗的有效性。一般进行以下项目的外源因子检测：1 .无菌实验（细菌、真菌、支原体）：依照国家规定的方式进行。2. 细胞法检测病毒外源因子：至少用107细胞和培育上清液转种 人二倍体细胞、本细胞系的其他批次、其他种属的细胞系，应无细胞 病变产生和血无吸附现象。3. 用动物和鸡胚检测病毒因子： 采用动物体内接种法检测外源病毒因子，对动物的要求、接种途径、接种剂量、观察时间、结果判定见表1。表1 动物体内接种法检测外源病毒因子动物组要求数量接种途经细胞浓 度（活细胞数 量 /ml）接种量（ml/只）观察天数结果判 定乳鼠24h内10（2窝）脑内 腹腔10721应健存成鼠1520g10脑内 腹腔2X106
