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1、大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。 营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养 的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。 原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要 求在表型上和野生型相同关于培养基：基本培养基(minimal medium, MM)：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用来表示。完全培养基(complete medium, CM):凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。用来表示。补充培养基(supplemental m
2、edium， SM):凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基,它是在基本培养基中加入该菌株不能 合成的营养因子而组成。摘要：本实验选用紫外线为诱变剂,来诱发大肠杆菌突变,并用青霉 素法淘汰野生型,逐个测定法检出缺陷型,获得100#大肠杆菌菌株, 最后经生长谱法鉴定出该菌株为xxx缺陷型。关键词：大肠杆菌 紫外线 营养缺陷型 青霉素 逐个测定法生长谱法一、目的1、了解营养缺陷型突变株选育的原理。2、学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。二、原理筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性 的浓缩、检出、鉴定缺陷型。本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发突变，并用青霉
3、素法淘汰野 生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷 型。三、器材 离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶， 试管，离心管，移液管，培养皿，接种针四、材料（一）菌种 E.coli（二）培养基、1 LB 培 养 液 （Luria-Bertani 培养 基,这个名字来源于英语的 lysogeny broth，即溶菌肉汤。是微生物学实验中最常用的培养 基，用于培养大肠杆菌等细菌，分为液态培养基和加入琼脂制成 的固态培养基。加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆 菌为宿主的克隆。）：酵母膏，0.5g；蛋白胨,1g； NaCl, 0.5g； 水，100ml，p
4、H7.2121C 灭菌 15min22XLB培养液：其它不变，水，50ml。3基本培养基：葡萄糖0.5 g, （NH4）2SO4 0.1 g,柠檬酸钠0.1 g, MgSO47H2O 0.02 g, K2HPO4 0.4 g, KH2PO4 0.6 g,重蒸水 100 mL, pH 7.2, 110C灭菌20 min。配固体培养基时需加2%洗 涤处理过的琼脂。全部药品需用分析纯,使用的器皿 需用蒸馏 水或重蒸水冲洗 23 次。4 无 N 基本液体培养基：K2HPO4,0.7g ； KH2PO4,0.3g; 柠 檬 酸 钠 3H2O,0.5g ； MgSO47H2O,0.01g;葡萄糖 2g；水
5、 100ml, pH7.0 110C灭菌 20min5 2N 基本培养基：K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠 3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g;（NH4）2SO4，0.2g;葡萄糖 2g；水 100ml, pH7.0 110C灭菌 20min6 完全培养基同 LB 培养基,配置固体培养基,需加 2%的琼脂。7 混合氨基酸和混合维生素五、步骤1 菌悬液制备1）取E.coli K12 一环加入到10ml LB培养液中在37C下过夜培 养；2）取0.3 “l菌液转接到10ml LB培养液中，在37C摇床上振荡培 养 46 小时,使细胞 处在对数生长期；3）
6、取适量菌液加入到5ml离心管中，7000rpm离心3到4 min,离 心 2 次,弃上清液, 打匀沉淀,各加入 4ml 无菌生理盐水,充分振 荡混匀。2 诱变处理1）取3ml菌悬液，加入到7cm小皿内，轻轻震荡使其均匀在皿 底形成一薄层。平放在灭菌的超净工作台上，盖盖灭菌lmin，然后 打开皿盖照射 2min（15W）。2）诱变后处理取3ml诱变后菌液加入到离心管中，7000rpm离心3到4分钟， 弃上清，加入4ml生理盐水离心洗涤2次，重悬于3ml生理盐水中， 取0.2 p l加入到5ml 2LB基本培养基内,37C培养过夜（后培养）。3 检出缺陷性菌株1）初筛：从培养12、16、24h的菌
7、液中，各自取100p l,分别 在LB完全培养基和基本培养基 上涂布2个平板，做好标记，在37C 下培养 36h。2）复筛：签挑取完全培养基上长出的菌落200个，分别点种在 基本培养基和完全培养基上，37C过夜培养。4 复证 挑取 LB 完全培养基上有而基本培养基上没有的菌落， 在基本培养基上划线复证，并在完全培养基上保留备份，37C过夜培 养。 24 小时后仍不长的为缺陷型。5 生长谱鉴定1） 营养缺陷型浓缩（淘汰野生型）3th day，延迟处理:吸菌液5ml于离心管中，3500rpm离心10min， 弃上清。离心洗涤两次（加生理盐水至原体积，打匀沉淀，离心，弃 上清，重复一次），最后加生理
8、盐水制成5ml菌悬液。取0.1ml菌液于5ml无N培养基中，37C培养12h。（消耗体内的 N 素，使停止生长，避免缺陷型被以后加入的青霉素杀死）4th day,按1:1比例加入2N基本培养液5ml,加5万U/ml青霉 素钠盐溶液100ul,使青霉素在溶液中的最终浓度约为500U/ml,再 放入37C培养。（野生型利用氮大量生长，细胞壁不能完整合成而死 亡,缺陷型因不长避免被杀死）。5出day，从培养12、14、16、24小时（根据实际情况，选择2-3 个时间段）的菌液中分别取0.1ml菌液到基本及完全培养基两个培养 皿中，涂布，37C培养。2）营养缺陷型检出7th day，检出营养缺陷型。上
9、述平板培养36-48h后，进行菌 落计数。选取完全培养基上长的菌落数大大超过基本培养基的那一 组，用灭菌牙签挑取完全培养基上长出的 菌落 100 个分别点种于基 本培养基和完全培养基上（先基本，后完全），37C培养。9th day，选在基本培养基上不长，完全培养基上生长的菌落在 基本培养基上划线，37C培养24h，仍不长的是营养缺陷型。3）营养缺陷型鉴定 在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对许多种生长因子的需求情况为生长谱法。单一生长因子：鉴定氨基酸或维生素的营养缺陷型，较为简便的方法 是分组测定法。 将21种氨基酸，组合 6组，每6种不同氨基酸归为 一组。如果以 15 种维生素进行测定，则把 5
10、种维生素归为一组，共 5 个组合。组别 氨基酸组合组1赖氨酸精氨酸蛋氨酸胱氨酸亮氨酸 异亮氨酸2缬氨酸精氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸组氨酸3苏氨酸蛋氨酸苯丙氨酸谷氨酸脯氨酸天冬氨酸4丙氨酸胱氨酸酪氨酸谷氨酸甘氨酸丝氨酸5鸟氨酸亮氨酸色氨酸脯氨酸甘氨酸谷氨酰胺6胍氨酸异亮氨酸组氨酸天冬氨酸丝氨酸谷氨酰胺组别维生素组合组1维生素A维生素 B1维生素 B2维生素 B6维生素 B122维生素 C维生素 B1维生素 D2维生素 E烟酰胺3叶酸维生素 B2维生素 D2胆碱泛酸钙4对氨基苯甲酸维生素 B6维生素 E胆碱肌醇5生物素维生素 B12烟酰胺泛酸钙肌醇10th day，生长谱的测定：将检出的营养缺陷型菌
11、落接种于5ml LB液试管中，37C培养1416h。11th day,培养16h的菌液离心。3500rpm, 10min，弃上清，加 生理盐水，打匀沉淀，再次离心。力口5ml生理盐水制成菌悬液。取其 1ml于培养皿中，加入融化后冷却到4050C的基本培养基，混匀， 平放，共二皿。（平板表面分别沾上沾有混合氨基酸 （或酪素水解液） 的滤纸片，30C培养24h,经培养后营养物质周围有生长圈，即表明 为氨基酸的营养缺陷型菌株）。将皿底分成分格用接种环依次放入少 许混合氨基酸等，37C培养24h,观察生长情况，确定是哪种氨基酸 营养缺陷型。生长谱鉴定点样图示六、实验结果与分析1、营养缺陷型检出点植对照
12、时每平皿点30株菌，最后在基本培养基上没有长出的菌 株，而在是完全培养基上长出菌落的，即为筛选出的营养缺陷型 菌株。2、营养缺陷型鉴定 通过如图1生长谱鉴定，得到如图2结果：生长谱鉴定结果图图2分析：如图中，1,2,3,4,5 任意区域有生长圈生成即对应为相应氨基酸 营养缺陷型菌株。七、结论与讨论结论：本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发大肠杆菌突变，并用 青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，获得 100# 大肠杆菌菌株，最后经生长谱法鉴定出该菌株为XXX缺 陷型。讨论：1、注意事项：紫外线对皮肤和眼睛有很大伤害，实验中 应避免人体暴露在紫外线中。各种器具、培养基及需 加入培养基中的试剂均需
13、灭菌。2、本实验中的突变型是氨基酸缺陷型，我们是可以检测的，如果是与N元素代谢有关的其他缺陷型，我们无法通过 这个实验检测。3、本实验中经紫外线照射后，诱变率较低，可能是因为 照射时间短，诱变剂量小，或者是黑暗培养不完善导 致光复活作用，可将诱变后的菌体进行后培养。八. 注意事项实验过程中要严格控制无菌，在菌落的选取、划线培养、菌悬 液的吸取、接种等环节 都要进行严格的无菌操作，任何一部的杂菌 污染都会对最终的实验结果造成严重影响。在用牙签筛选点种的时候要注意牙签不能将培养基戳破，这样不 利于菌落的生长，也 不利于观察，另外还要注意点样的顺序是先基 本培养基后完全培养基。在基本培养基上的点接量
14、一定要少，以防止 细胞过多及细胞老化而导致自溶现象的发生，从而引起缺陷型突变体 也可以在基本培养基上生长的现象。在倾注平板时培养皿必须在使用之前严格的无菌，培养基的温度 要严格控制，否则容 易烫死加入的细菌或者由于凝固而使混匀失败。在最后一步鉴定营养缺陷型时要注意氨基酸的点样不能过多，要 用牙签蘸取氨基酸后 轻轻抖动即可。如果点样过多会造成氨基酸在 培养基中的扩散，从而对实验结果产生影响。拓展讨论 倾注培养法进行生长谱的鉴定有其优点。由于氨基酸 没有经过灭菌处理，而且在氨基酸点样过程中很容易发生受杂菌污 染，这样就很有可能导致培养基的表面有杂菌菌落产生。比如这时候 采用涂布法，那极有可能引发实验的干扰，产生假阳性。而用倾注法 的菌落不容易扩散，能够将菌落限定在特定的区域，细菌可以利用外 来的氨基酸，那么菌落生长圈就会出现在培养基内部，这样我们只观 察透明培养基的内部的生长圈情况就可以了。 而对于倾注法存在的 问题，第一，它还是没能更高程度地避免染菌，因此也要求我们的 无 菌操作精度要高。第二，倾注平板时容易将菌杀死，而对于这个情况 的掌控，只能依靠人为的感觉。第三：倾注平板容易造成平板不平， 或者不均，影响菌的生长和观察。
