脯氨酸含量的测定

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1、脯氨酸含量的测定水分胁迫下植物的渗透调节【实验目的】1. 了解植物对环境胁迫的抗性生理作用，及植物对胁迫的影响机制；2. 了解脯氨酸对植物水分胁迫下的抗性生理。【实验原理】在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline, Pro） 的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱 性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生 理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程， 因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增 加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标

2、。在酸性条件下，茚三酮和脯氨酸反应生成稳定的红色化合物，产物在 520nm 波长下具有最大吸收峰。用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水 杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理， 则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。【材料、仪器及试剂】1. 实验材料：小麦幼苗：对照；100mM、200mM NaCl处理48h； 5%、15% PEG-6000 处理 48h2. 仪器：天平，烧杯 ，分光光度计，研钵，容量瓶，具塞试管，移液管， 胶头滴管，水浴锅3. 主要试剂： 3%磺基水杨酸、冰醋酸、甲苯（使用完勿弃入下水道，请回收）、2.5%酸性茚

3、三酮溶液（60 ml冰醋酸、16.4 ml磷酸加蒸馏水定容至100 ml，再 加入2.5 g茚三酮，溶解后避光保存）、脯氨酸标准母液：精确称取25 mg脯氨酸， 倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入500 ml容量瓶中，加蒸馏水定容 至刻度，此标准液中脯氨酸浓度50 Mg /ml。【实验步骤】（一）、样品的测定1脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.2g （每种处理至少 做三个平行），用 3%磺基水杨酸研磨提取，分别转移至试管中，然后向各试管分 别加入5ml 3%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min,（提取过程中要经常 摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液用3%磺基水杨

4、酸定容至5mL，即为 脯氨酸的提取液（预先湿润滤纸，尽量全部收集 Pro 提取液）。2. 吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸 性茚三酮试剂，封口以防过分蒸发，在沸水浴中加热30min,溶液即呈红色。3. 冷却后加入4ml甲苯，摇荡30s,静置2h。4. 用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对 照，在分光光度计上 520nm 波长处比色，求得吸光度值（注意甲苯有毒，尽量 防止挥发；OD520大小为0.2-0.8之间为佳，若值太高，应适当用甲苯稀释）。（二）、标准曲线的绘制1在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解

5、， 然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100 M g。2. 系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5,1.0, 1.5, 2.0, 2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为 1， 2， 3， 4， 5 及 6M g/ml。3. 取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml 酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。4冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至 甲苯溶液。5. 用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空 白对照

6、，于 520nm 波长处进行比色。6. 标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（卩 g/2ml）。【实验记录及结果处理】根据标准曲线计算出 2ml 样品液中脯氨酸的浓度,然后换算出样品中脯氨酸 的含量（pg脯氨酸/gFW）。计算公式如下：脯氨酸含量（pg.g-i） = c X（v/ a） / wc为由标准曲线查得脯氨酸含量pg、V为提取液总体积ml、a为测定液体积mL、 W为样品质量g,即脯氨酸含量（U g/g） = （c X 5 / 2） /样重（g）一）、标准曲线绘制浓度（卩g/ml）0246810

7、OD52000.0816670.1410.2056670.3063330.338667二）、样品含量测定不同处理的待测植物根尖质量对照100mMNaCl200mMNaCl5%PEG-600015%PEG-60000.2092g0.2182g0.2124g0.2159g0.2097g0.2058g0.2177g0.2080g0.2182g0.2036g2mL样品中脯氨酸吸光值OD520abab对照0.1400.0830.1270.095lOOmM NaCl0.1320.1180.1390.110200mMNaCl0.0980.0650.1180.0895%PEG-60000.5100.4820.

8、3170.14715%PEG-60000.1070.1720.1370.103根据标准曲线计算出2ml样品液中脯氨酸的浓度（g/ml） （y=0.0347x+0.00522ml样品脯氨酸浓度（|J g/ml）abab对照3.8852.2423.5102.588100mM NaCl3.6543.2513.8563.020200mMNaCl2.6741.7233.2512.4155%PEG-600014.54813.7418.9864.08615%PEG-60002.9344.8073.7982.818换算出样品中脯氨酸的含量（pg脯氨酸/gFW）【脯氨酸含量（卩g/g） = （cX 5 / 2）

9、/样重（g）】脯氨酸含量（pg 脯氨酸/gFW）abab对照46.42726.79342.63831.438100mM NaCl41.86537.24844.24034.649200mMNaCl31.47420.28039.07529.0265%PEG-6000168.458159.113102.95646.81515%PEG-600033.97957.30846.63634.602将上表中两组的四个数据浓度求均值对照：脯氨酸含量= 36.824 （pg脯氨酸/gFW）lOOmM NaCl处理：脯氨酸含量= 39.501 （pg脯氨酸/gFW）200mMNaCl处理：脯氨酸含量= 29.964

10、 （pg脯氨酸/gFW）5%PEG-6000处理：脯氨酸含量=119.338 （pg脯氨酸/gFW）15%PEG-6000处理：脯氨酸含量=43.131 （pg脯氨酸/gFW）【分析及讨论】1. 实验表明，PEG胁迫处理的植株中脯氨酸含量明显高于对照组，Nacl条件下， 脯氨酸含量变化不是很明显。2. 非盐性植物在胁迫下，通常降低细胞的渗透势以利于吸水，从而维持整个植物 的水势，渗透势的调节可以通过以下两条途径达到：一是植物体内积累一些无机 离子和可溶性有机物来降低自身渗透势；二是通过植株叶片气孔收缩，从而降低 气孔导度以降低叶片的蒸腾作用，减少水分的丧失。3. 由于脯氨酸具有偶极，性其疏水端与蛋白质连结，亲水端与水分子结合，从而 使蛋白质通过脯氨酸束缚更多的水，防止在渗透胁迫下蛋白质脱水，并可防止和 减轻由于渗透胁迫而引起酶蛋白的变性。因此脯氨酸的积累在调节细胞的渗透势 和稳定蛋白质特性方面有着重要的作用。4. PEG胁迫的小麦积累了较多的脯氨酸进行渗透调节，降低细胞内的渗透势，从而保持小麦内环境的相对稳定，以致小麦能正常生长，但长势没有对照组的好。