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1、文件编号 版本 鲎试剂灵敏度复核试验作业指导书修订历史记录至多存五版的历史修订记录版本发行日期文件更改申请编号修改内容1.0 目的 对细菌内毒素检查试验所用的鲎试剂的灵敏度进行复核。2.0 职责质量与法规部负责本规程的起草，QC及相关人员执行本规程。3.0 范围 适用于本公司细菌内毒素检查法。4.0 参考文件2010年版中国药典二部 附录XI E细菌内毒素检查法2010 年版中国药品检验标准操作规范细菌内毒素检查法 细菌内毒素检查法及其应用第一版，气象出版社5.0 定义 鲎试剂灵敏度复核试验：在细菌内毒素检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素 的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度（入），用E
2、U/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试 验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。反应终点浓度：指鲎试剂灵敏度复核试验中，系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结 果的浓度。6.0 设备/工具及物料6.1 设备/工具6.2物料6.2.1 细菌内毒素工作标准品 除另有规定外，使用由中国药品生物制品检定所统一 发放的标准品。6.2.2细菌内毒素检查用水指内毒素含量小于0.015EU/ml （凝胶法）且对内毒素试 验无干扰的灭菌注射用水。6.2.3 鲎试剂规格一般选用 0.25 EU/ml。7.0 操作步骤7.1提前30 min开启超净工作台，试验操作过程中不要开启风机，完
3、毕后用75%乙醇擦拭 超净工作台。试验操作过程应防止微生物和细菌内毒素污染。7.2制备细菌内毒素标准溶液7.2.1 取细菌内毒素工作标准品 1 支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈上部划痕，用 75%乙醇擦拭后启开，避免玻璃屑落入瓶内。7.2.2 按照工作标准品说明书，加入细菌内毒素检查用水溶解。封口膜封口，置漩涡 混合器上混匀15 min后用细菌内毒素检查用水进行稀释，制成2.0入、1.0入、 0.5入、0.25入四个浓度的内毒素标准溶液。每稀释一步均应在漩涡混合器上混 匀 30 s 。注：在使用过程中，标准品溶液若静置超10min，必须重新混匀30s再重新使用。7.2.3 试验举例设细
4、菌内毒素工作标准品为100 EU/支；待测鲎试剂入=0.25 EU/ml。稀释过程 如下：取细菌内毒素标准品100 EU/支+1 ml检查用水一 100 EU/ml取 0.2 ml 100 EU/ml 溶液+1.8 ml 检查用水一 10 EU/ml取 0.2 ml 10 EU/ml 溶液+1.8 ml 检查用水一 1 EU/ml取 0.9 ml 1 EU/ml 溶液+0.9 ml 检查用水一 0.5 EU/ml取 0.9 ml 0.5 EU/ml 溶液+0.9 ml 检查用水0.25 EU/ml取 0.9 ml 0.25 EU/ml 溶液+0.9 ml 检查用水f 0.125 EU/ml取
5、0.9 ml 0.125 EU/ml 溶液+0.9 ml 检查用水0.0625 EU/ml 即得2.0入、1.0入、0.5入、0.25入四个浓度的内毒素标准溶液。7.3溶解鲎试剂731取0.1 ml装量的鲎试剂18支，安甑开启过程同6.2.1工作标准品。732每支鲎试剂加入0.1 ml细菌内毒素检查用水溶解，在试管架上按下面的形状排 列。注：在复溶鲎试剂时，应使用可调式移液器连接无热原吸嘴加样，而不是使用移液 管加样。鲎试剂复溶后不能放到漩涡混合器上去混合，因为强烈混合容易使复溶后 的鲎试剂产生泡沫，影响凝胶的形成。实际上只需将鲎试剂复溶后静置12分钟鲎 试剂就可变澄清。OO 5OOOO4o
6、o O 0 3o o O 0 2OOOO!度细7.4加样（鲎试剂安瓿排列如下图）第1列每支加入2.0入浓 的细菌内毒素标准溶液0.1 ml 第2列每支加入1.0入浓度的 菌内毒素标准溶液0.1 ml第3列每支加入0.5入浓度的 菌内毒素标准溶液0.1 ml第4列每支加入0.25入浓度的细菌内毒素标准溶液0.1 ml第5列每支加入细菌内毒素检查用水0.1 ml，作为阴性对照 注：每次加样浓度必须是从高到低，加不同浓度的样品需更换新的移液器吸嘴。7.5 加样结束后，用封口膜封口，将鲎试剂安瓿中溶液轻轻混匀，应避免产生气泡，连同 试管架垂直放入37C 士 1 C的恒温水浴箱中，试管架保持水平状态，保
7、温60 min 士 2 min。使用温度计监测恒温水浴箱温度是否满足实验要求，每 30 分钟进行温度记录，记录 表格参见。7.6 判断及计算7.6.1 将鲎试剂安瓿从恒温水浴箱中轻轻取出，缓缓倒转 180，若管内形成凝胶，并 且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性“”；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、 变形并从管壁滑落者为阴性“”。注：保温和拿取鲎试剂安瓿的过程应避免受到振动造成假阴性结果。762当最大浓度2.0入4管均为阳性，最低浓度0.25入4管均为阴性，阴性对照管为 阴性，试验方为有效。7.6.3按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（入c）入c=lg-i （工X/4）式
8、中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准 溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。当入c在0.5入2入（包括0.5入和2入）时，判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，方 可用于干扰试验和供应品细菌内毒素检查，并以标示灵敏度入为该批鲎试剂的灵 敏度。7.6.4 试验举例如果待复核的鲎试剂的标示灵敏度为0.25 EU/ml，试验结果如下:内毒素标准 溶液浓度（EU/ml）2.0入（0.5）1.0入（0.25）0.5入（0.125）0.25 入（0.0625）阴性 对照反应终点 浓度（EU/ml）重 复 管 数1+-0.252+-0.253+-空0.1254+-空0.25则鲎试剂灵敏度的测定值Ac= lg -i （工X/4）=lg -1 （lg0.25 + lg0.25 + lg0.125 + lg0.25） / 4 =0.21 EU/ml结果入c在0.5入2.0入范围内，符合规定。以标示灵敏度0.25EU/ml为该批鲎试剂的 灵敏度入。8.0 记录和表格设备温度记录表鲎试剂灵敏度复核试验报告 注：在细菌内毒素测试报告中填写复核数据、复核结果、日期、检测人签名等相关内容。
