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1、实验报告学院：第二临床医学院专业：临床医学年级：2013级班级：1班姓名： _学号：_日期：2014,3,8 得分：实验课程：生物化学实验实验名称：蛋白质的定量测定(五)一一考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度【实验目的】掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。【实验原理】考马斯亮蓝G-250 (CoomassieG-250 )是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染 料，在465nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收入max的位置发生红移，在595nm处有最 大吸收值。由于蛋白质一考马斯亮蓝复合物
2、在595n处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的 光吸收，因此可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量 在 1ug 左右。【试剂与器材】试剂：考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml质量浓度为0.85g/ml 的磷酸，用蒸馏水稀释到1 0 0 0 m l 。标准蛋白质溶液：结晶牛血清清蛋白，预先经微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量，然后根据该蛋白的纯度
3、用0.15mol/LNacl配制成1.0mg/ml蛋白溶液。器材：试管和试管架722 型分光光度计 吸量管移液枪【实验步骤】一、 制作标准曲线管号0123456标准蛋白质溶液/ml00.20.40.60.81.000.9%Nacl10.80.60.40.200溶 液/ml考马斯亮蓝实剂/ml5555555各管混匀后，静置3min，以0号管为空白管调零，在595nm波长下分别测定各管溶液的吸光 度值（A595）.以A595值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。二、待测蛋白质浓度测定测定方法同上，1ml待测蛋白质家5ml考马斯亮蓝试剂,。用上述0号管调零，测出血清的A595值。【实验结果】
4、essQa5 _ua.一舵性（嵋光農值）Ou 40.B1O2II.管号0123456吸光度值0.1560.1970.2620.2920.3190.3620.119由仪器测量可得A595=0.179，可得标准蛋白质溶液为0.0790mg/ml.【注意事项】 必须在试剂加入后的 520min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。 测定中蛋白-染料复合物会有少部分吸附在比色杯壁上，测定完后可用乙醇将比色杯清洗干净。【思考与讨论】一、考马斯亮兰法的突出优点是：（1）因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因 而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的
5、多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5 分钟左右。由于染料与 蛋白质结合的过程，大约只要 2 分钟即可完成，其颜色可以在 1 小时内保持稳定，且在 5 分钟至 20 分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用 像 Lowry 法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+、离子Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、 巯基乙醇、 EDTA 等均不干扰此测定法。二、此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 Bradford 法用于不同蛋白质 测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 TritonX-100 、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH （如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用 Beer 定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未 知蛋白质的浓度。三、试验时应当注意分光光度计、吸量管、移液枪的正确使用。
