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1、利用限制性内切酶分析法检测镰刀型细胞贫血症限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性探针来检测是否存在基因变异。当待测序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。如：（200湖5北3）镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。检测这种碱基序列改变必须使用的酶是解旋酶连接酶限制性内切酶聚合酶解析：根据碱基互补配对原则可采用分子杂交原理或探针的方法。采用加热等一定的技术手段将患者的分子片段与正常人的分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离
2、的单链。解旋酶的作用是分子在复制或转录时将双链解开，在本题中加热也可以解开达到目的,所以不是必须的酶；连接酶和限制性内切酶都是基因工程的工具酶，一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割分子的基本骨架上脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，连接酶的作用和它正好相反，是将限制酶切开的缺口缝合起来。而聚合酶则是在基因转录过程中促进核糖核苷酸形成分子的酶，本题就是采用限制性内切酶分析法解题的。必须使用的酶就是限制性内切酶，故选C根据分子杂交原理知，将患者的分子片段与正常人的分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链，
3、有无双链便是区别，为什么又要用限制性内切酶将其切开再杂交呢？回答这个问题我们先看看。天津I下图为人B珠蛋白基因与其杂交的示意图，表示基因的不从本题看出基因的单链的编码区与其转录的成熟的之间可以杂交形成杂合链，但是它们两者之间不仅不是完全互补，相反有两个内含子对应的单链部分所含有的上百个核苷酸，根本没有对应互补的部分，这就说明它们之间相差很大也能够杂交，只不过结果有突起部分而已，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因只有一个碱基发生突变，难道用正常基因转录的就不能与只突变一个碱基的基因杂交形成杂合链吗？应该是肯定可以,如果这样来检测，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因的检测结果是相同的，就找不到区别，无
4、法鉴别。所以必须采用限制性内切酶分析法来检测才有效，具体是先找到一种限制性内切酶，切开控制镰刀型细胞贫血症基因的对应部位的正常基因，这样就形成两短段，也同同一种酶来切镰刀型细胞贫血症基因，因为镰刀型细胞贫血症基因发生了一个碱基的突变，这样相同的限制性内切酶就无法切开，就还是完整的一长段，在用以上三段对应的已标记的进行杂交（此过程可以不用任何酶，通过控制温度来打开氢键和连结氢键），然后电泳，如果出现两短段的则是正常基因，如果只出现一长段则是突变基因，如果都有的说明两者都存在，可视为杂合。利用相关知识点命题的请看如下高考试题。:江苏8单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。镰刀型细胞贫血症是
5、一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病。已知红细胞正常个体的基因型为、，镰刀型细胞贫血症患者的基因型为，有一对夫妇被检测出均为该致病基因的携带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。下图为其产前核酸分子杂交诊断和结果示意图。突变的血红蛋白基因riIIIIIIIIIIII -i正常的血红蛋白基因II 占占矗十店占矗ET盂M二I凝胶电泳分离酶切片与探针杂交显示的带谱图注f限制酶酶切点突变碱基探针杂交区域带谱从图中可见，该基因突变是由于碱基对改变或变成引起的。巧合的是，这个位点的突变使得原来正常基因的限制酶切割位点丢失。正常基因该区域上有个酶切位点，突变基因上只有2个酶切位点，经限制
6、酶切割后，凝胶电泳分离酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱，正常基因显示条,突变基因显示条。或分子探针要用放射性同位素或荧光分子等等标记。利用核酸分子杂交原理，根据图中突变基因的核苷酸序列，写出作为探针的核糖核苷酸序列0根据凝胶电泳带谱分析可以确定胎儿是否会患有镰刀型细胞贫血症。这对夫妇次妊娠的胎儿II中基因型的个体是II一和II一，的个体是II一，的个体是II一。解析比较基因和和突变后的基因的碱基组成，发现它们的差别仅是基因一条链某一位点上的碱基突变成基因一条链某一位点上的碱基（实质上对应的另一条链上的碱基也发生了改变）。据图观察，正常基因经限制酶切割后，凝胶电泳分裂酶切片段，与探针杂交
7、后可显示出不同的带谱都是二条，而突变后的基因，经限制酶切割后，与探针杂交后可显示出不同的带谱都是一条。所以，在分析推断胎儿IIII的基因型时，可以这样认为：基因型的个体同时带有基因和基因，所以其应同时含有与基因对应的二条带谱，与基因对应的一条带谱（这也可以从I和I得到验证）。符合这个条件的仅有II3同理，基因型为的个体应仅有与基因相对应的二条带谱，符合条件的是II和II。的个体是只能是含有与基因相对应的一条带谱，为II。作为探针的必要条件之一是要易于识别，所以可用放射性同位素或荧光分子等进行标记。既可以用脱氧核苷酸链作探针，也可以用核糖核苷酸链作探针，题干中明确要求用核糖核苷酸链，所以，特别要注意当链上的碱基是时，作探针用的链上的碱基应为U通过如上分析可知，限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性探针来检测的方法，即是酶切和核酸分子杂交两种技术的综合分析方法。核酸分子杂交技术在体外进行的时候可以不用相关酶，但是限制性内切酶无法用温度等外界环境的控制来代替。限制性内切酶分析法现在的使用很广泛，女口：在柯萨奇组病毒型检测及分型中的应用利用软件对柯萨奇型病毒全序列进行了限制性内切酶酶切位点的分析，目前从理论上推测该方法几乎可以检测所有遗传病的变异基因，近几年高考试题也是屡屡出现所以提醒广大师生在高考复习备考过程中应多加重视。
