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1、CCK8的实验步骤、实验分组及检测方法毕业季就像在打怪，一个不小心，就会犯错。就像最近需要提供 可以打论文制作费的银行卡，我明明在备忘录中备注了，还设置了提 醒，但是还是忘记了。今天研究生处老师找我才想起来。刚哥说是因 为我已经很久没怎么进食碳水化合物，所以神经紊乱，记忆减退，最 主要是会忘事、变笨。有文献报道称长期生酮饮食会造成神经系统的 紊乱，出现失眠、记忆减退、精神衰弱等神经精神症状。瞬间觉得这 个猜测有一定的道理，今天早上就开心的吃了一根玉米。结果可能是 碳水戒断现象，吃了可能 2 个小时不到，就困得不行，特别想睡觉。 哎，到底是吃还是不吃呢。后来想通了，既然是类似戒断现象，那就 慢慢
2、加量，明天早上吃1/3 根。先给大家分享一点我这周的小小体会和收获吧。我有个师妹，人 小小个，但能量还挺大的。在我未正式和她有接触之前，她属于那种 懵懵懂懂的小女生，也不是特别清楚自己在做什么，但有个很大的优 点，很心细，另外执行能力也还行。在我们成为了伙伴，一起工作的 这大半年中，我们一起扩了病毒，一起养了细胞，一起拍了照，一起 认识了很多新的东西。她的改变非常大，实验越做越好，知道去问为 什么，知道查询相关文献。我也越来越放心她单独做实验。最近，我发现她有个特别牛逼的技能，就是可以用把肺组织切片 切得非常漂亮，有层次感，可以切到肺上皮细胞的纵切面，可以切到 气管的纵切面和横切面，而且切得好
3、的概率越来越大，什么都不多说， 看下图 1，2（这还不是最好的，因为我没有那部分数据）。我问过她， 有没有什么诀窍，她也是糊里糊涂的。不过从现在开始，她已经是个 实验有心人，开始注意在每一次石蜡切片的标本脱水、固定、切片的 每一个步骤，做好了记录。希望在不久的将来她可以写个帖子跟大家 分享石蜡切片的手法。其实我跟很多人都讲过我做实验的经验教训， 她是比较能听进去的那一类。她现在都可以和我一起讨论课题了，我 甚是欣慰。我记得我得硕士老板在我最开始做实验的时候，跟我说过，在我们起步比较晚的时候，最开始都是不段模仿、重复，最后才能赶上，然后才有创新，才有超越。而最难的就是早期的模仿、重复。那是一 个
4、需要建立知识体系的时间段，只有把那个难关闯过，你后面才知道 把你学到的东西放到知识体系相应位置，然后才会有一定的规律可循， 才能看到食物的内在联系，才能创新。她是一个坚韧、有大智慧的人。 这一番话，受益至今。今天分享给大家，希望在那段重复、模仿，看 不到任何希望的日子里，常常激励自己，彼方尚有荣光在。这周还有一个开心的事情，之前和果子老师一起做了一个单克隆抗体。在他的建议下，做了一个蛋白相互作用的芯片。我为什么需要 做这个芯片呢，是因为我研究的那个蛋白之前做 Co-IP 拉出来的蛋白 送质谱分析后有一个数据，后来用酵母双杂交或者 GST-pulldown 都 没有把我想要的东西做出来，而这个芯
5、片是从物理角度来看两个蛋白 的相互作用。我想说的是，这个芯片把我之前没做成的事情验证清楚 了。特此感谢果子老师一次。相互作用的蛋白做了聚类分析后，有我 之前预判的，也有新发现的。科学研究就是那么有意义，那么的迷人， 你永远不知道结局是什么。你只有不停的做，才会有不同的发现，课 题也才会有一次次的修订，最后得出一个相对正确的结论。今天就跟大家絮叨到这了。这周主要分享的就是 CCK8 的实验步骤、实验分组、及检测方法 上周我们已经知道 CCK8 是什么，以及它的用途。这周先来看看 CCK8的实验步骤。实验步骤:制作标准曲线（此步骤必须要好好做）从上周的帖子中，我们知道细胞数目、细胞状态对 CCK8
6、 的值影 响很大。另外，虽然说 10%的 CCK8 溶液对细胞培养影响不大，但是 一个异物在培养基中待太久，也会影响细胞状态。做过显色实验，比如测定蛋白浓度或者 ELISA 的人，细心一点都 会发现，这个显色反应有一定的饱和度（不是指终止反应后），也就 是它的化学反应随着时间变化是呈一个“S”型的。那就意味着，如果 反应时间延长，原本有差别的两组数据就会变得没差别。所以时间也 很关键。在sigma的很多测ATP、NADPH、糖原的这些盒子，最后 都是算的速度或者酶反应学中的K值。下面开始讲实验步骤，其实每个公司的实验步骤都大同小异，我 在分享步骤的同时，也会分享一点小窍门。1. 先用细胞计数板
7、计数细胞悬液中的细胞数量（此处也多说一句，细胞最好不要超过10人8/mL,细胞一定要吹打均匀，呈单细胞，呈单细 胞，呈单细胞），然后准备接种细胞；2. 倍比稀释一个细胞浓度梯度，在 96 孔板中，我常规稀释的浓度 如下：1000, 2000,5000,10000,15000,20000,25000,50000 个/孔， 共8个浓度。每组4-6个复孔，每孔100 pL培养基（此处培养基不需 要加抗生素）；3. 接种后根据细胞的类型不同，悬浮细胞通常培养4小时。贴壁细 胞根据细胞种类不同，培养 2-4 小时，主要使细胞贴壁又没开始进入 分裂期（注意使用排枪将）。4. 然后每100 pL培养基加10
8、 pL CCK-8溶液。要是实验技术不成 熟，害怕没有完全把液体加进去的，我用过的两种解决办法，一种是 加完后，使用水平离心机，500G , 1min，短暂离心；另夕卜一种是将 CCK8 放入培养基中制成 10%的液体，对细胞进行换液。后一种方法 有一些些弊端，下周仔细分析。5. 一般的试剂盒说明书会告诉你，试剂培养一定时间后测定 OD 值。那这个一定的时间是多少呢，这个需要你自己在做标曲时就应该 清楚。我通常会在加入 CCK8 液体后观察液体颜色的变化，在 1 小时 开始测定OD值，湖面基本每隔1小时测一次，总共测6-8次。6. 关于测定波长，一般的试剂盒推荐使用450nm吸光度。我喜欢 用
9、双波长进行测定，检测波长450nm，参比波长600nm。不知道检 测 波 长 和 参 比 波 长 的 可 以 参 考 此 篇 帖 子 ， 连 接 如 下 ： https:/ ml7. 最后制作出一组以时间为为横坐标，OD值为纵坐标的多条曲线 及一条以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线。根据此标准 曲线可以测定出未知样品的细胞数量。使用此标准曲线的前提条件是 试验条件完全一致。我就之前我做的HeLa 229细胞举一个例子。1.Hela229 按 0 ， 1000,2000,5000,10000,15000,20000,25000,50000 个/孔铺板。细胞的贴壁时间从铺板后1小时开始（
10、康宁的96孔板，每个牌子的孔板细胞贴壁时间是不一样的，对了血清也会影响细胞贴壁，所以一定要做预实 验），4小时基本可以完全贴壁，6小时就开始有细胞在增殖，进入分 裂期。所以在我的这个体系下，做标曲选择时间为铺板后 4 小时，细 胞培养基为100pLo2. 细胞贴壁完全后，使用量程为2-20U的排枪加入10pL CCK-8 溶液，轻轻混匀。3. Beckman水平离心机短暂离心，500G，1min。4. 取出放入孵箱，每隔一个小时测定2次读数，检测波长450nm，参比波长600nm。一共读取6次读数。5. 用其他孔细胞数值减去细胞数为0孔，得到一组数据。6. 制作以时间为为横坐标，OD值为纵坐标
11、的多条曲线，如下图3f 25000-亠 20000+ 15000斗 10000=*+50OTt 十 2000= + 1000从图3我们可以知道在加入CCK8 4小时时，各个细胞稀释浓度的50000读数较稳定，所以我们选择 4 小时的数值做一组以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线，如下图453.52,容 uosq5O.r 1000 r 2DQD r 500Q10000r 15000 r 20G0Or 25000r 500000.t20.170.3021.011 542 543.44CCK-8 standard curve of HeLa 229 clls标准曲线可以做线性的，但我个人比较
12、喜欢二项式。其实标准曲线的建立也就是我们正式实验的良好基础。从上述标 准曲线中，我可以知道在96孔板中到我检测的时候，细胞数在5000- 25000 个的时候比较准确。另外我还知道在加入 CCK8 4 小时检测效 果比较好。大家注意哈是在检测时，而不熟铺板时。那怎么粗略计算 铺板时的细胞数呢？ 需要考虑以下几个问题：1. 细胞的增殖速度，多少小时繁殖一代。（这里又涉及到，不同 的铺板浓度，不同代数的细胞增殖速度不一样）2. 实验所需时间，你加了药物或者做了什么处理后，多少小时测 定。这些都需要成竹在胸。细胞活性检测1. 在96孔板中接种单细胞悬液（100 |JL/孔），放在孵箱中培养12-24
13、小时。2. 在每孔加入10 pL的CCK-8溶液（注意不要产生气泡）。3. 短暂离心（可选择不做）。4. 将培养板置于培养箱内孵育 1-6小时；5. 用酶标仪测定在450 nm处及600 nm处的吸光度。 细胞增殖-毒性检测1. 在96孑L板中接种细胞悬液（100 pL/孔）,放在孵箱中培养 12-24小时。2. 在每一空中加入不同浓度的待测药物。3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（预实验结果或者根据 文献报道）。4. 在每孔加入10 pL的CCK-8溶液（注意不要产生气泡）。5. 短暂离心（可选择不做）。6. 将培养板置于培养箱内孵育 1-6小时；7. 用酶标仪测定在450 nm处及600 nm处的吸光度。我们都知道 CCK8 反应原理是一个氧化还原反应，那如果你的药 物是氧化还原反应相关的药物，加入 CCK8 反应之前，更换新鲜培养 基（此处有坑，如果操作不当会影响结果）。当待测药物影响较小时 可以直接扣除培养基中加入待测药物后的空白吸收即可。好了，今天就分享到这里，送大家一张美图（手机拍摄），希望大家心胸开阔，天天都有好心情。我们下周四见。
