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1、天津科技大学研究生学位论文(申请硕士学位) 定向改造酿酒酵母积累丙酮酸的研究STUDY ON DIRECTELY TANSFORM SACCHAROMYCES CEREVISIAE FOR ACCUMULATE PYRUVIC ACID 专业名称：发酵工程指导教师：高年发 教授研究生姓名：邓旭衡申请学位级别：工学硕士论文提交日期：2011年1月分类号：Q751 学校代码：10057密级：（秘密、机密、绝密） 研究生学号：08809005定向改造酿酒酵母积累丙酮酸的研究Study on Directly Transform Saccharomyces Cerevisiae for Accumul
2、ate Pyruvic Acid 专业名称：发酵工程指导教师姓名：高年发 教授研究生姓名：邓旭衡申请学位级别：工学硕士论文提交日期：2011年1月论文课题来源：自选学位授予单位：天津科技大学天 津 科 技 大 学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究工作所取得的成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果内容，也不包括为获得天津科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：日期： 年 月 日知识产
3、权和专利权保护声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师具体指导下并得到相关研究经费支持下完成的，其数据和研究成果归属于导师和作者本人，知识产权单位属天津科技大学；所涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科技大学所有。本人保证毕业后，以本论文数据和资料发表论文或使用论文工作成果时署名第一单位仍然为天津科技大学。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，同意公布论文的全部或部分内容，允许论文被查阅和借阅。本人授权天津科技大学可以
4、将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保 密 （请在方框内打“”），在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密 （请在方框内打“”）。作者签名： 日期： 年 月 日导师签名： 日期： 年 月 日摘 要丙酮酸是一种重要的有机酸，它广泛地应用于化工原料、药物及农用化学试剂的生产和研究中。目前生产丙酮酸的方法主要有化学合成法、生物催化法和生物发酵法。化学合成法、酶催化法合成具有原料难得、结构复杂、成本较高，不适于大规模生产，而且合成的丙酮酸酸多为外消旋混合物等缺点，因此利用微生物法合成丙酮酸酸成为发展趋势。发酵法生产丙酮酸的主
5、要研究思路和目标是：（1）减少丙酮酸的进一步降解及转化；（2）加快发酵底物葡萄糖的酵解速度，提高生产强度。酿酒酵母作为一种研究和应用最为广泛的真核微生物，发酵生产乙醇具有极好的优势。在厌氧条件和溢出代谢情况下，经糖酵解生成的丙酮酸几乎全部或大部分流向生产乙醇的支路，从而产生乙醇的积累；同时酵母细胞具有较高的耐受性，可以积累较高浓度的乙醇。通过合理利用产乙醇的代谢流向，将乙醇的代谢流引向丙酮酸的积累，为丙酮酸的生产提供了新的思路。本论文就是研究定向阻断酿酒酵母丙酮酸的进一步代谢，从而积累丙酮酸。以菌株S. cerevisiae Y2为出发菌株，把pdc1基因敲除片段用电穿孔转化法转化到出发菌株S
6、. cerevisiae Y2中，在含G418抗性的YEPD平板上筛选转化子，通过PCR验证得到pdc1基因的敲除菌株S. cerevisiae Y21。然后把pdc5基因敲除菌株敲除片段用醋酸锂转化法转入到S. cerevisiae Y21中，在YNBG平板上筛选转化子，通过PCR验证得到pdc1和pdc5基因都缺失的菌株S. cerevisiae Y215。然后用southern blot进一步验证S. cerevisiae Y2 pdc1和pdc5基因的缺失。为比较丙酮酸脱羧酶基因敲除后酶活的变化，分别测定S. cerevisiae Y2，S. cerevisiae Y21和S. cer
7、evisiae Y215的丙酮酸脱羧酶的活性，结果发现S. cerevisiae Y21和S. cerevisiae Y215的丙酮酸脱羧酶的活性较S. cerevisiae Y2分别减少了31%和98%。对基因敲除菌株和出发菌株进行简单发酵实验，结果发现丙酮酸的产量有显著提高，S. cerevisiae Y2，S.cerevisiae Y21和S. cerevisiae Y215的发酵120h的丙酮酸产量分别为1.24g/L、2.894g/L、9.264g/L。为进一步提高S. cerevisiae Y215的丙酮酸产量，对其种子培养基、发酵培养基和发酵条件进行了优化，优化后种子培养基为（g
8、/L）：葡萄糖30，蛋白胨10，酵母粉5，KH2PO4 1，MgSO47H2O 0.5，醋酸钠2，玉米浆0.5%，pH 5.6；优化后发酵培养基为（g/L）：葡萄糖80，蛋白胨20，酵母粉10，醋酸钠2.5，玉米浆1%， KH2PO4 1，MgSO47H2O 0.5，金属离子母液5mL，pH5.6；最佳发酵条件为：种龄26h、接种量12%、装液量70mL/250mL三角瓶，发酵96h。S. cerevisiae Y215在最佳发酵条件下丙酮酸的积累量为24.85g/L，比优化前提高168%。关键词：丙酮酸；基因敲除；酿酒酵母；代谢工程；丙酮酸脱羧酶ABSTRACTPyruvic acid is
9、 an important organic acid, which widely used in production and research of chemical raw materials, pharmaceutical and agricultural chemical reagents medicin and agrochemicals. Currently, the methods for product pyruvic acid include chemical synthesis, biocatalysis and biological fermentation. Howev
10、er, the common chemical synthesis and enzymatic synthesis are not suitable for mass production of pyruvic acid because they thave many shortcomings: the raw materials are rare, complex, costly and the products always is a racemic mixture, so the use of microbial synthesis of pyruvic acid is a trend.
11、 The main ideas and objectives of fermentative production of pyruvic acid are: (1) to reduce the further degradation and conversion of pyruvate; (2) To accelerate the glycolysis rate of fermentation substrate: glucose, increase production intensity.Saccharomyces cerevisiae is the most thoroughly inv
12、estigated and the most widely used eukaryotic microorganism, which has excellent advantages for fermentation production of ethanol. In anaerobic conditions and overflow metabolism, the pyruvate generated by glycolysis almost all or most of the slip flow to produce ethanol, resultied in the accumulat
13、ion of ethanol; while yeast cells have a high tolerance on ethanol so it can be accumulated to a higher concentration. Through correct design of the flow of ethanol metabolism, change alcohol metabolism flow toward to the accumulation of pyruvate provides a new way for producr pyruvate. This paper i
14、s to study the directional blocking further metabolism of pyruvate in S. cerevisiae to accumulate pyruvate.The pdc1 knockout fragment was transformed into S. cerevisiae Y2 by using electroporation, transformants were screened on YEPD plates containing G418 resistant and were validated by PCR to get
15、the pdc1 gene disrupted strain S. cerevisiae Y21. Then the pdc5 gene knockout fragment was transformed into the Y21 by lithium acetate, transformants were screened on YNBG plates and were validated by PCR to get the S. cerevisiae Y215 with both pdc1 and pdc5 gene disrupted. The dispruption of pdc1 and pdc5 gene were further validated by southern blot. To compare the changes of pyruvate decarboxylase activity in gene knockout, the PDC act
