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1、材料和试剂：DMEM培养基，细胞板，中性红，琼脂糖，PBS或无抗无血培养基，1ml和10ml 移液管等。操作步骤：1PK15细胞铺细胞板，细胞密度要较高，才容易形成空斑（但太高了也不好，有 可能会形成很多层细胞，导致有的细胞形成病变的地方有其他层的细胞没有坏死 也被染色从而无法形成空斑）。2过夜后，用无抗无血的培养基清洗洗吧，然后再进行病毒吸附，原液进行10 倍倍比稀释，自己可以摸索一下感染稀释度，一般病毒价较低的时候，可以降低 稀释度。看空斑形成情况，要是空斑形成太大，连成片，就得增加稀释度。3吸附1-2小时，用无抗无血培养基（或无菌PBS）清洗2-3遍后配制第一次覆 盖液。使用1.6%的琼
2、脂糖（加热至液体状）和两倍DMEM溶液等体积混合，逐 滴加到细胞板中。没孔加入1-2ml覆盖液。放置于37度培养箱中培养。4每天观察细胞病变情况，出现明显病变时进行二次覆盖，覆盖液和第一次差不 多，只是要加入细胞染色液中性红（0.1%）, 般体积比为10ml： 10ml： 1ml（可以适当增加一点，如果染色效果不良的话）。5染色5H以上应该就可以观察染色情况，理论上伪狂犬病毒应能形成白色空斑 而PCV2不会产生空斑。在不知道PCV2在哪里的情况下，我们随机挑取若干个 没有空斑的细胞，而后进行传代。应该可以得到无伪狂犬污染的PCV2病毒种。1蚀斑实验需要细胞长至什么程度可以接毒？显微镜下观察，一
3、般情况下，铺满细胞板底部即可，这样不会造成空洞影响蚀斑 观察。不同的细胞不一样，一般时候是长满T25的细胞传一个六孔板，第二天 就接毒。2细胞上用什么覆盖物？琼脂？琼脂糖？低熔点琼脂糖？浓度应该是多大？ 我用的是lonza公司的低熔点琼脂糖，终浓度是0.75%。感觉不错，就是挺贵的， 2k+人民币。3如果做挑斑纯化，是不是就不可以染色，染色后对毒力有何影响？不染色就可以看出来，因为培养基本身里面就含有酚红呈现颜色，形成的斑没有 颜色，可以直接挑斑；我也染色后挑过，感觉影响不大，可能不同病毒不一样吧。4由于细胞上有覆盖物，那么该如何挑斑？我用的是1ML的蓝色枪头，提前剪掉尖端部位，使枪头口径与蚀斑大小相仿即 可，然后用移液器直吸取蚀斑，覆盖物也一起被吸入枪头。
