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1、脓汁和粪便标本中病原菌的检测2011级第二临床医学院临床五年制第7组学号姓名一.实验目的1.脓汁和粪便标本据有不同的病原菌，本实验主要探究检测 其病原菌的类型并通过一系列的观察与鉴定从而确定其病原菌的名称和性质。2.学习培养基的制备、消毒和灭菌,细菌的分离与培养,细菌群体和个体形态特征的观察，细菌生化反应鉴定等技巧。从中掌握微生物实验的各种操作方法，培养对微生物实验的兴趣。二实验器材1器材接种环 接种针 打火机 油性笔 酒精灯 污物盘 普通 冰柜隔水式电热恒温培养箱奥林巴斯CX21型生物显微镜 试管（带棉塞）刻度吸管洗耳球称量纸药勺牛皮纸硫 酸纸橡皮筋尺子锥形瓶高压蒸汽灭菌器银子玻片吸 水纸拭
2、镜纸2 试剂药品干粉培养基蒸丫留水脓汁标本粪便标本石蜡油乙醇1=和乙醞（7:3 ）混合液 生理盐水 结晶紫 卢戈碘液95%乙 醇稀释复红葡萄糖微量发酵管（2支）孚L糖微量发酵管（2 支）青霉素抗菌素纸片链霉素抗菌素纸片庆大霉素抗菌 素纸片兔血浆诊断血清（痢疾血清）三. 方法与步骤1培养基的制备干粉培养基-蒸丫留水-加热溶化一分装-集中放在试 管筐里,然后罩上硫酸纸，牛皮纸，用橡皮筋扎好一放入 讲台边的高压灭菌筐内T送到高压灭菌室灭菌f摆斜面,倾 注平板-检定培养基的效果一4弋冰箱保存备用（制备出普 通平板6个,依红美蓝平板2个,固体斜面培养基4个，液 体培养基4个,半固体培养基4个）2.细菌的
3、分离与培养 （1）细菌的分离:烧灼灭菌接种环-分别取脓汁标本与粪便标 本点在普通平板和依红美蓝平板上，各做两份-烧灼接种环 上的多余的标本-在平板上划曲线一移动平板依次划五区(2)细菌纯培养：先观察上述(1)实验中平板分离出来的菌 落T接种环烧灼灭菌-挑选平板上典型的四种单菌落(白 色、黄色、紫黑色、粉红色)进行斜面接种纯培养，并做好 标记f接种环烧灼灭菌T培养不得超过18小时-保存备用。1=1接种环烧灼灭菌f分别取斜面培养实验中培养得到的四 种菌苔适量接种到液体培养基中-接种环烧灼灭菌-35C 培养4-6小时，备用。4细菌个体形态特征的观察(1 )玻片标本制备。取两块玻片，在每块玻片上加生理
4、盐 水34ul 2滴 在一块玻片上取堇色和白色菌苔少讯1mm 小菌落的半量)与盐水混匀,涂成lcm ;在另一块玻片上 取紫黑色和粉红色菌苔少许(1mm小菌落的半量)与盐水 混匀,涂成lcm2。经在空气中干燥后,再用酒精灯对其进 行固定。(2 )革兰染色。结晶紫初染1分钟一水洗-卢戈碘液媒染1 分钟-水洗-95%乙醇脱色约30秒钟-水洗-稀释复红复 染1分钟-水洗-吸干,镜检。5细菌生化反应鉴定(1)糖酵解试验。用接种针分别挑少许紫黑和粉红色的细 菌接种到葡萄糖发酵管和乳糖发酵管中。将微量管平放在平 皿盖内，在37弋下，培养24小时，观察其产酸产气情况。(2)血浆凝固酶试验。取二滴兔血浆置于洁净
5、的玻片上T 接种环烧灼灭菌T分别用接种环取斜面纯化培养所得到的白色和黄色菌苔与血浆硏磨混合亠边混匀边观察结果-接种环烧灼灭菌观察结果。(3 )半固体接种法。 接种针斜面取四种不同颜色的细菌, 刺入，到达培养基底部4/5处，再循原来的路线，退出接种 针。在37弋下，培养24小时,观察结果。各自接种进四个半固体培养基，从半固体培养基中心,垂直1=1=6.菌药物敏感性试验接种环分别取黄、白、紫黑、粉红色四种菌液2环，各自 在四个平板上，作平板密集划线接种细菌(纱窗样)0设计 三点，三点之间等边三角距离,点距离平皿边缘约15mm0 作标记：青、链、庆。银子火焰消毒，夹取相应的药物纸片, 平贴在已设定的
6、位置上，按压，最后银子火焰灭菌。37迄1824小时培养,观察结果。7 .玻片凝集试验取洁净干燥的载片一片，分试验与对照区-滴加生理盐水15ul ,置于对照区中心；滴加诊断血清15ul ,置于试验区中 心接种环烧灼灭菌用接种环取粉红色的菌苔,分别研厘 乳化于盐水或血清内,混合均匀一接种环烧灼灭菌一观察结 果一玻片放进玻片缸内。四. 结果结果显示:脓汁标本在普通培养基上形成白色和黄色两种 菌落；粪便标本在伊红美蓝培养基上形成紫黑色和粉红色两 种菌落。结果如图2所示。含脓汁标本的营养琼脂培养基含粪便标本的伊红美蓝培养基图22经革兰氏染色后在显微镜下的形体特征结果如下图，总结可得表10革兰氏阳性菌革兰
7、氏阴性菌标本脓汁粪便菌落颜紫黑色带金属光淫粉红色半透明形态G+球菌，排列不规则,呈葡萄串状G-杆菌,散在排列鉴是什么细菌黄色葡萄球的萄球套白色葡3黄色与白色两种细菌进行血浆凝固酶实验结果：观察到黄色菌落的细菌能使血浆产生颗粒性物质,说明 其为凝固酶阳性，是致病菌；白色菌落细菌不出现凝集反应, 说明其为凝固酶阴性,不是致病菌。结果如图30图3 （左为黄色菌落,右为白色菌落）4.紫黑色与粉红色两种细菌生化试验的结果结果如图4左边两个发酵管为紫黑色标本右边两个为粉红色左为粉红色,右为紫黑色总结得下表菌落葡萄糖发酵乳糖发酵动力试验紫黑色分解糖，产酸又产 气分解糖，产酸又产 气有鞭毛粉红色分解糖，产酸不
8、产气不分解糖无鞭毛5药敏实验结果实验图片如图50总结表格如表2紫黑细菌黄色细菌白色细菌粉红色菌图5圉落黄色白色紫黑色粉红色青霉素+-链霉素+庆大霉素+备注：+为敏感,为耐药表2&痢疾血清玻片凝集反应的结果观察到紫黑色菌落的细菌不能使痢疾血清产生颗粒性物 质,说明其不是引起痢疾的致病菌；粉红色菌落的细菌使痢 疾血清产生颗粒性物质，说明其是引起痢疾的致病菌。结果 图6。标本菌落形态血浆葡乳半固福痢青链庆结论固酶体血清&结论脓汁黄色G +球+全黄色葡萄球菌白色G +球+白色葡萄球菌粪便紫黑G -杆+大肠埃希菌粉红G -杆+福氏志贺菌综上可整理得表3表3五. 实验讨论1实验反思及分析。我们组的实验大部
9、分实验结果符合客观 事实。但在油镜下观察革兰氏阳性菌可见大块染色块,影响 了实验的观察。产生的原因可能是在染色时没有冲洗干净或 者使用3液脱色时间不够,这点细节以后会多加注意。2注意事项(1) 在革兰染色的操作当中，所取得菌量不能太多，如果 取得太多的菌量会在镜检时看到细菌与细菌之间重叠,分布 过于密集,常常会导致假阳性的出现。另外,革兰氏染色的 关键在于严格掌握酒精脱色程度,如脱色过度,则阳性菌可 被误染为阴性菌：而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。 因此应该要操作迅速,控制在30秒以内。此外，染色时通 常会用新鲜的细菌培养物,因为菌龄会影响染色结果,如阳 性菌培养时间过长,或已死亡及部分
10、菌自行溶解了,都常呈 阴性反应。(2) 在糖发酵试验当中,存放的时间不应过长,否则会使 产气的微量发酵管的气体排出,导致所看到的现象不准确。(3) 在操作动力实验的过程中，接种针应该要顺着原路退出，如果此过程中接种针左右摆动了，会出现本没有鞭毛的 细菌经培养呈现一片浑浊,难以判断是操作有误还是细菌的 运动所致。(4) 实验的各个环节都要严格进行无菌操作如果无菌操作 不严格,会产生杂菌影响实验结果。3总结与心得。经过此次实验，我不仅学到了鉴别和分离细菌的方法和理论知识,同时也了解了常规微生物实验操作的 技巧。我意识到每一步都很关键,个细节的失误可能导致 整个实验的失败,所以不仅要扎实地掌握理论知识,更要注 重实践操作的练习,尽量提高实验过程的效率和实验结果的 准确率。
