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1、实验 1 淀粉酶的离子交换层析一、摘要 采用离子交换树脂分离蛋白，掌握离子交换柱层析法的基本操作技术。用层 析柱、蠕动泵、自动部分收集器、紫外分光光度计等仪器洗脱蛋白质分子，成功 分离纯化，得到洗脱曲线，得出穿透峰、洗脱峰 1、洗脱峰 2三个峰。二、材料与设备淀粉酶溶液、离子交换树脂、平衡缓冲液、洗脱缓冲液1（含0.3M氯化钠 的平衡缓冲液）、洗脱缓冲液II （含0.5M氯化钠的平衡缓冲液）、蒸馏水、20*lcm 层析柱、试管架、蠕动泵、自动部分收集器、紫外分光光度计、100ml烧杯*2、 100ml量筒、胶头滴管、1ml移液枪、玻璃棒。三、实验步骤1、装柱：取直径lcm,长度20cm的层析柱
2、。将柱垂直安装于铁架上。自顶 部注入处理好的树脂悬浮液，树脂沉降时，多余的液体从出口流出，不 断缓慢添树脂悬浮液，至树脂沉降至15cm左右的高度即可。2、平衡并调整流速：在层析柱中充满平衡缓冲液,将上端柱头旋紧,用大 约 20ml 平衡缓冲液平衡树脂，同时将流速调整为 2.0ml/min。3、上样：打开柱子上端柱头，让柱内缓冲液流出，液面与树脂面相切，关 闭出口；由柱上端仔细加入蛋白样品0.5ml,打开出口，让样品进入树脂， 同时开始收集流出液；当柱内液面与树脂面相切时关闭出口；加入0.5ml 平衡缓冲液，打开出口，待缓冲液面与树脂面相切时关闭出口，再加入 0.5ml缓冲液，重复此步骤。缓慢添
3、加平衡缓冲液直至顶端，旋好柱头。4、洗脱：采用不断提高离子浓度的方法阶段洗脱蛋白。以2.0ml/min流速， 用体积为50ml平衡缓冲液、50ml洗脱缓冲液I、50ml洗脱缓冲液II分 三段洗脱；3min收集一管，体积大约为6ml，测定各管A280nm。5、绘制洗脱曲线，收集吸收峰的试管。四、 实验结果官数123456789A280nm0.0250.0170.0060.0040.0150.0190.0150.0140.014官数101112131415161718A280nm0.0510.1360.1420.1250.1070.0870.0800.0690.071官数1920212223242
4、5A280nm0.0840.0790.0750.0640.0600.0570.053洗脱曲线五、讨论1、由洗脱曲线可得到三个吸收峰，达到实验要求，实验结果表示蛋白质分 子被洗脱下来，达到分离的效果。2、得到的吸光值偏小，原因可能是在平衡树脂时所用的平衡缓冲液少于20ml，使柱内pH未达到所需pH,造成差异；也可能是上样时，添加缓 冲液过快是的样品被稀释，造成误差。六、结论 淀粉酶成功分离纯化，得到洗脱曲线及三个吸收峰。七、参考文献1 翟胜强. 分光光度计使用中不容忽视的几个问题. 计量与测试技 术,2010,37(9):37-38.2 黎卫强.紫外分光光度计在食品检测中的应用 .企业科技与发 展,2010(6):15-16.3 王慧超,陈今朝，韩宗先 a-淀粉酶的研究与应用重庆工商大学学报(自然科学版),2010,27(4):368-372.4 史伟，禹婷.蛋白质的层析分离.内蒙古农业科技,2011(1):110-112.
