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1、蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳、转膜及显色过程步骤高征2014年6月 第一部分细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程碧云天试剂盒rm一、原理在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组 份就是细胞核和细胞浆。 分离细胞核蛋白和细胞浆蛋 白， 不仅可以用于研究蛋白在细胞内 的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研 究，例如EMSA (也称 gel shift) , footprinting 等。细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cy toplasmic ProteinExtraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜
2、组织 中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。约90 分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋 白与细胞浆蛋白的分离。抽提得到的蛋白可以用于Wes tern, EMSA， foot pri nting,扌报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B,在低渗透压条件下， 使细胞充分膨胀,然后破坏细胞膜,释放出细胞浆蛋白, 然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。本试剂盒可 以抽提50 个样品,如果每个样品的数量为约二百万细胞或约30-50毫克组 织。二、注意事项1. 需自备PMSF。PMSF 定要在抽提试剂加入到样品中前2-3 分钟内加
3、入,以免PMSF在水溶液中很快失效。2. 抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4C进行。3. 本试剂盒对于组织样品,仅适合于新鲜组织,对冻存过的组织抽 提效果很差。可以抽提的组织样品数通常不足100个。4. 使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云 天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S 测定蛋 ）白浓度。但不适合用 Bradford 法测定蛋白浓度。5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。三、使用说明1.准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上， 混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试
4、剂 A 备用，在使用 前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数 分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mMo（蛋白酶抑制剂可酌情翻倍）2对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液（0.5%处理5min） 处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心（ 1400r/min 5min）收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽 量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。3. 对于悬浮细胞：用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上 清，留下细胞沉淀备用。4. 每20微升细胞沉淀加
5、入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂 Ao （对于二百万Hela细胞，其细胞沉淀的体积大约为20微升或40毫克。）5. 最高速剧烈涡旋震荡5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。（如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长震荡时间。）（时间可稍长，保 证细胞破碎）6. 冰浴10-15分钟。7加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10微升。最高速剧烈Vortex 5秒，冰浴 1分钟。8. 最高速剧烈Vortex 5 秒，4C 12,000T6,000g 离心5分钟。9. 立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可 以立即使用，也可以冻存。 （千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小
6、 体积的上清，以免触及沉淀。 ）10. 对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入50 微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。（不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。）11最高速剧烈Vortex 15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后 放回冰浴中，每隔1-2 分钟再高速剧烈 Vortex 15-30 秒，共30 分钟。12.4C12,000-16,000g 离心 10 分钟。13. 立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白 可以立即使用，也可以-70C冻存。14. 对于新鲜组织：A. 把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照20:1的比例混合适当量的 细胞浆蛋白抽提试剂 细胞浆蛋白抽
7、提试剂 试剂B）。并加入组织匀浆液。按照每A和B （例如200微升A 中加入 1 0微升抽提PMSF 至最终浓度为1mM 配制成60mg组织加入 200 微升组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液，并在玻璃匀 浆器内充分 匀浆。匀浆需在冰浴或4C进行。B. 匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，冰浴放置1 5 分钟。C. 4C1,500g离心5分钟。把上清转移至一预冷的塑料管中，为抽提 得到的部分细胞浆蛋白。吸上清时千万不要触及沉淀。D. 对于沉淀，到了这一步已经充分匀浆，但很多细胞还没有破碎。接下去按照使用说明的步骤 4开始操作， 即 把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作， 按 照步骤 4 至步
8、骤 13抽提得到细胞浆蛋白和细胞核蛋白。抽提得到的 细胞浆蛋白可以和步骤14C中抽提得到的细胞浆蛋白合并。第二部分蛋白定量-BCA法（南京建成试剂盒）一、实验仪器：试管、微量移液器、旋涡混匀器、37C水浴箱（气浴箱）、 可见分光光度计（ 562nm）二、适用范围： 本试剂盒可测各种动物血清（浆）、组织、培养细胞、细胞培养上清 及植物等样本中的蛋白含量。三、试剂组成及配制： 取试剂一粉剂1 支与试剂一稀释液 溶解完全后试剂一 ：粉剂 2支、稀释液12.5 ml 2 瓶 试剂一应用液的配制1 瓶混匀4度待用。试剂二:250 口丨2支：按 试剂一应用液：试剂二=50:1工作液的配制 的比例配制，混匀
9、后待用，用多 少配多少。试剂三：终止剂储备液20ml 1 终止剂应用液稀释后备用，瓶：取终止剂储备液用双蒸水 5倍4 度冷藏0.2ml 1-20 冷试剂四:563 ug/ml蛋白标准液支， 4度保存 1个月（可分装冻）1、样本前处理： 、动物组织样本：准确称取组织重量，按重量（g）:体积 （ml）=1:9 的比例，加入 9 倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，2500 转 /分，离心 10 分钟， 取上清液，待测。 、植物组织样本：准确称取组织重量，按重量（g）:体积 （ml）=1:9 的比例，加入 9 倍体积的匀浆介质，冰水浴条件下机械匀浆，3500 转 /分，离心 10 分钟， 取上清
10、液，待测。 、血清（浆）样本：按血清（浆）：生理盐水=1 : 49的比例稀 释，待测。 、其它液体样本：按比例稀释，测定范围为202000|1 g/ml, （不同的样本稀释度不一样）的预实验。2、操作表： /，请在批量测试前先做 12 个样本管空白标准官测定管双蒸水（n l）2000563 口 g/ml标准品0200(U 1)待测样本（u 1）0020工作液（u 1）250250250漩涡混匀，37C 孵终止剂应用液750育3075分0 钟750漩涡混匀，静置15 分钟562nm波长，水调零0.5cm 光径测各管OD值五、计算公式：六、测定原理：碱性条件下，蛋白将 CU2+还原为Cu+与BCA
11、试剂形成紫色的络合物， 处有最大吸收峰，过测吸光度即可计算待测蛋白的 浓度。七、检测范围 检测浓度下限达到量达到0.5|i g,在Cu+，562nm依据吸光度与浓度成比例，通20|i g/ml,最小检测蛋白202000 u g/mlWestern blot相关试剂配制浓度范围内有良好的线性关系。 标准曲线范围：标准品浓度（1 g/ml）绝对0D值0250000.499A 30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis） ：丙烯酰胺（Acr）,29g; N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis） , 1g,去离子水溶解，37C水浴助溶，定容至100mL。0.45口 m 滤器过滤，棕色瓶4C避光保存。8. 10%
12、十二烷基硫酸钠（SDS）: SDS, 10g; H2O, 80mL。68C加 热溶解，浓HCl调pH至7.2，定容至100mL，室温保存。C. 10%过硫酸铵（AP）： AP,1g；H2O,10mL。避光4C保存。（4C2周)D.分离胶缓冲液（1.5MTris-HClpH8.8)：Tris,18.17g；H2O 80mL。用浓 HCl调pH 至 8.8,定容至100mL,4C保存。E.浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HClpH6.8)：Tris,12.11g；H2O 80mL。用浓 HCl调pH 至 6.8,定容至100mL,4C保存。F.电泳缓冲液（10X）:甘氨酸（Glycine),188
13、g; Tris 30.2g; SDS,10g; H2O,800mL。调节pH至8.3,定容至1L, 4C保存(用时稀释为1 X)。G5X SDS-PAGEIoadingBuffer ( 5mL): 1MTris-HCI( pH6.8)， 1.25mL； SDS，0.5g;溴酚蓝(BPB)， 25mg;甘油，2.5mL;加去离子水定容至5mL。充分混匀，分装成 500 u L/份，室温保存。使用前每份加入25口 LB -巯基乙醇 (2-ME),加入2-ME的loading buffer可在室温下保存一个月左右。H考马斯亮蓝染色固定液：40%双蒸水,10%醋酸,50%甲醇，室温保存I 考马斯亮蓝染
14、色液：考马斯亮蓝R-250, 250mg ;甲醇，45ml ;冰醋酸，10ml ;H2O,定容至100ml。室温保存。J 考马斯亮蓝染色脱色液：醋酸， 100ml； 乙醇，50ml； dH2O 850ml， 充分混合， 室温保存K膜转移缓冲液：甘氨酸，2.9g; Tris,5.8g; SDS,0.37g;加H20 600mL 充NaCl，800 H2O 搅NaCl，800 H2O0.5 ml Tween 20 1L，4 C保1L 烧杯，加入约800ml 去离子水分溶解，力口200mL甲醇，混匀，定容至1L,室L TBS 缓冲液：8.8g; 1M Tis-HCL (pH 8.0), 20ml，加入约拌溶解，定容至1L,4C保存。MTBST缓冲液：8.8g; 1M Tis-HCL (pH 8.0), 20ml，加入约搅拌溶解，加入后充分混匀，去离子
