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1、实验五 油菜自交不亲和性鉴定一、目的 了解植物自交不亲和性的表现特征，掌握植物自交不亲和性的鉴定方法。二、内容说明植物的自交不亲和性是指能产生具有正常功能且同期成熟的雌雄配子的雌雄同体植 物，在自花授粉或相同基因型异花授粉时不能完成受精的现象，是花粉与雌蕊相互作用的综 合结果。受单一位点或多位点的自交不亲和基因控制。自交不亲和性广泛存在于十字花科、禾本科、豆科、茄科等许多植物中，十字花科中 自交不亲和性尤为普遍。自交不亲和株正开放花的柱头上，如果授于同株或同系统的花粉时，柱头就被激发产 生胼胝质等物质，阻碍花粉发芽和花粉管发育，故不能正常受精结实，不结子或结少量种子； 而授于别的品种或系统的花
2、粉时，则柱头不会被激发产生这类物质，故能正常受精结实。但 在花蕾柱头上，即使授于同株或同系统的花粉也不会被激发这种反应，因此可通过蕾期人工 控制自交获得自交不亲和系的种子。可根据自交结实情况对自交不亲和性进行判断，以自交亲和指数来表示。自交亲和指数=自交结实种子总数/套袋自交总花蕾数；自交亲和指数VI者为自交不亲和；自交亲和指数三1者为自交亲和。胼胝质是01、3葡聚糖，通常分布于高等植物的筛管、新形成的细胞壁、花粉粒以及花粉管中，将其用苯胺蓝染色后，在紫外光激发下，可发出黄至黄绿色的荧光。把授粉后经用苯胺染色的子房放到荧光显微镜下观察，可看到花粉在柱头上萌发、花 粉管发育的状态，以及胼胝质在柱
3、头表面的沉积状况等，进行判断花粉与柱头是否亲和。三、材料与用具1 、实验材料：自交不亲和材料：白菜型油菜；自交亲和材料： 甘蓝型油菜。2、仪器用具：荧光显微镜、广口瓶（2050ml）、载玻片、盖玻片、镊子、铅笔、纸牌、纸 袋、甲醛、冰醋酸、无水乙醇、普通酒精、磷酸钾、苯胺蓝、氢氧化钠、甘油、蒸馏水等。四、试验方法步骤（一）自交亲和指数测定法1 、套袋自交：选35株已开花且发育健壮的植株，每株上选34 个花序，摘除已经开放的花朵和角果，然后套上纸袋，并在相应的花序上挂牌标记。2、蕾期人工强制自交：在每个花序上选择1015个较大的花蕾，用镊子轻轻摘除幼小的花 蕾。开花后未散粉前，用镊子小心摘取本株
4、上隔离袋内新鲜花朵的花药（粉），授到开放花 朵的柱头上，即进行花期人工强制自交。（二）荧光显微法Martin（1959）发现水溶性苯胺蓝能显示花柱中花粉管的伸长情况：在荧光显微镜下，对 于大部分附着于柱头上的 SSI 花粉，看不见它们的花粉管穿过乳突细胞，一经穿过乳突细胞 的少数SSI花粉管，会长驱直入，到达子房，完成授精。因此，可根据穿越花柱的花粉管数 量来测定自交不亲和性。1. 试剂配置（1）FAA 固定液：将 40%甲醛、 80乙醇和冰醋酸，按1:8:1 的比例配制而成。（2）卡诺固定液：用 3 份无水乙醇和 1 份冰醋酸配制而成。（3）0.1N磷酸钾水溶液：称取71g磷酸钾，用蒸馏水定
5、容至1000ml。（4）0.1%苯胺蓝溶液：称取0.1g水溶性苯胺蓝，用0.1N磷酸钾水溶液定容至100ml。（5）8N氢氧化钠溶液：称取32g氢氧化钠，用蒸馏水定容至100ml。2. 取样、固定和保存解开自交授粉 612h 的花枝上的纸袋，摘取子房，于花柱基部切下花柱，将花期授粉和蕾期授粉的花柱分别固定于FAA固定液或卡诺固定液中，24h 后，转移到70%乙醇溶液中保存。在瓶上注明株号、花期授粉还是蕾期授粉处理以 及试验者姓名。3. 透明和软化将上述固定材料用水冲洗后，转移到指形管中，用8N氢氧化钠溶液浸泡824h。4. 染色把软化后的试材用自来水多次换水浸泡1h以上，除去大部分氢氧化钠溶液
6、之后，转移 到0.1%苯胺蓝染液中染色4h左右。5. 观察用镊子挑取一枚染色后的花柱，放在载玻片上，用滤纸吸出染液，滴上一滴甘油，盖上 盖玻片，轻轻敲压盖玻片，使花柱展开。然后把载玻片放到荧光显微镜下，观察记载每株柱 头胼胝质沉积状况，花粉萌发及花粉管生长状态。6. 统计花粉管数量和伸长状况，判断自交不亲和情况依据 Georgia (1982)提出的判断甘蓝自交不亲和性的标准；在花柱中能观测到010 条花粉管的定为不亲和， 1025 条为部分亲和， 25 条以上者为亲和。复习思考题、作业题：1. 学生课前预习，并写出详细的预习报告；2. 课前查阅文献资料，了解自交不亲和性的不同测定方法；3. 完成表格作业并分析实验中存在的问题并通过思考或相互讨论找出相应的解决办法
