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1、绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆摘 要绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅、珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。提取菌落中的pEGFP-N3质粒，用PCR技术扩增目的基因片段；以PMT18-T 质粒为载体，直接与PCR产物相连，将重组DNA导入感受态细胞，进行蓝白斑筛选，再扩大培养；再次提取质粒，用限制性内切酶将含有目的基因的片段切下，通过凝胶电泳鉴定该片段是否含有目的基因即可。关键词GFP荧光蛋白 基因克隆 PCR 基因重组1. 前言1.1 绿色荧光蛋白概述绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物
2、发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60处理。1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心螺旋的反平行折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-T
3、yr-Gly自身环化和氧化形成.1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心螺旋的反平行折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。 图1 绿色荧光蛋白示意图1.2 应用价值在生物学研究中，科学家们常常利用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体的标记。将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。生物学家一直利用这种标记方法，把原本透明的细胞或细胞器从黑暗的显微镜视场中“纠出来”。后
4、来，美籍华人钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理，并对它进行了大刀阔斧的化学改造，不但大大增强了它的发光效率，还发展出了红色、蓝色、黄色荧光蛋白，使得荧光蛋白真正成为了一个琳琅满目的工具箱，供生物学家们选用。目前生物实验室普遍使用的荧光蛋白，大部分是钱永健改造的变种。 有了这些荧光蛋白，科学家们就好像在细胞内装上了“摄像头”，得以实时监测各种病毒“为非作歹”的过程。通过沙尔菲的基因克隆思路，科学家们还培育出了荧光老鼠和荧光猪，由于沙尔菲与钱永健的突出贡献，他们与绿色荧光蛋白的发现者下村修共享了今年的诺贝尔化学奖。 瑞典皇家科学院将绿色荧光蛋白的发现和改造与显微镜的发明相提并论，成为当代生物
5、科学研究中最重要的工具之一。生物技术中的应用研究：分子标记、药物筛选、融合抗体、生物传感器。2. 实验目的 通过质粒提取、PCR扩增、电泳等技术进行绿色荧光蛋白基因的克隆。熟练掌握相关实验技术。3. 实验原理3.1 质粒DNA的提取SDS为阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平
6、时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。 3.2 PCR扩增类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加 热至95左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延
7、伸：DNA模板-引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。组成PCR反应体系的基本成分包括：模板DNA、特异性引物、耐热DNA聚合酶、dNTP以及含Mg2+的缓冲溶液。因此，PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种dNTP存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。3.3 DNA的连接与转化3.3.1 pMD18-T VectorpMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物的
8、专用载体。本载体有EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。此外，本制品中的高效连接液Solution 可以在短时间内（约30秒钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌的转化，大大方便了实验操作。3.3.2 感受态细胞体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。感受态就是细菌吸收转化因子
9、的胜利状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。3.3.3 阳性克隆的检测DNA片段成功插入至pMD18 Vector中后，一般情况下-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体是，基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。所以，当我们没有得到白色菌落时，可以试着检测蓝色菌落。Contr
10、ol Insert经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA片段。3.4 酶切反应与凝胶电泳3.4.1 酶切反应限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。图2 限制性酶切位点本实验中，质粒 DNA约3 kb ，载体pMD18-T 约2.7kb，基因 CHD5 约0.4 kb。可由此判断限制性内切酶切下含有目的基因片段约800b，作为电泳鉴定的依据。3.4.2 凝胶电泳电泳为带电粒子在电场中泳动的现象。共价闭环超螺旋DNA线性DNA开环的双链环状DNA琼脂糖（Agarose ）是一种多聚糖，由半乳糖及其衍生物构成的
11、中性物质，不带电荷。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。4. 实验设备4.1质粒DNA的提取BIOEASY质粒小提试剂盒，微量移液器，离心机，紫外分光光度计4.2 PCR扩增PCR扩增仪、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管、4.3 DNA的连接与转化移液枪，微量离心管，水浴锅，振荡器，琼脂平板培养基，牙签4.4 酶切反应与凝胶电泳微量移液器、离心机、恒温水浴箱、紫外检测仪、电泳仪、水平电泳槽5. 实验材料及试剂5.1质粒DNA的提取BIOEASY质粒小提试剂盒:溶液S1（细菌悬浮液） 50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/LEDTA，25 mmol/L Tri
12、s-HCl (pH 8.0)，2毫克/毫升溶菌酶裂解液S2 :200 mmol/L NaOH， 1% SDS中和液S3: 3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液洗涤液W洗脱液RNase A(100mg/ml)DNA吸附柱5.2 PCR扩增样品：质粒DNA试剂： 引物 ：引物1、引物2，工作浓度为10umol/L。TaKaRa Taq dNTP Mixture PCR Buffer。 灭菌去离子水。5.3 DNA的连接与转化pMDTM18-T Vector，Insert DNA灭菌蒸馏水，Solution ，DH5感受态细胞，限制性内切酶EcoR I、Hind III5.4 酶切反应与凝胶
13、电泳大肠杆菌DH5菌株、pMD18-T载体、易瑞质粒小量提取试剂盒Takara EcoRI 限制性内切酶、Takara Hind III 限制性内切酶Takara 10 M 酶切缓冲液BioWest电泳琼脂糖干粉、0.5TBE核酸电泳缓冲液、EB 核酸荧光染料、Takara 6 电泳上样缓冲液6. 实验操作步骤6.1质粒DNA的提取6.1.1 DNA提取1, 取1.5ml培养物加入Eppendorf管中，室温离心12000rpm1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。2, 加入250l 溶液S1中，旋涡振荡，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。3, 加入250l 裂解液S2，颠倒46次混匀（不
14、要剧烈振荡），室温静置3min（不超过5min）。4, 加入350l 中和液S3，立即温和颠倒68次混匀，至出现白色絮状沉淀。5，室温12000rpm离心10min。6, 分次小心取上清液转至吸附柱中（带收集管），每次600l，室温12000rpm离心30s，弃滤液，将吸附柱重新放回收集管中。7, 向吸附柱中加入600l 洗涤液W， 12000rpm离心30s ，弃滤液。8, 重复步骤7一次。9, 空柱10000rpm离心2min。10,取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50l 56 预热的洗脱液，室温放置1min，12000rpm离心1min，收集洗脱液（即纯化的质粒DNA
15、）， -20保存备用。6.1.2 质粒DNA定量测定1，取2ml提取的质粒DNA，加入98ml蒸馏水2，混合均匀3，用紫外分光光度计测定A2606.2 PCR扩增6.2.1 PCR反应体系的设置（1） 预混合液（Premix）的配置试剂容量TaKaRa Taq1.25U/25uldNTP Mixture2*conc; 各0.4mMPCR Buffer2*conc；3mM Mg保存温度：-20.（2） 准备PCR反应溶液试剂容量Premix Taq25ul模板*0.1ul引物1 (10uM)2ul引物2（10uM)2ul灭菌蒸馏水20.9ul6.2.2 PCR仪上操作（1） 参数设置PCR的反应条件： 3 Step PCR94 30s30 cycles 50或60 30s72 60s2 Step PCR 98 10s30cycles68 1 min/ kbp * (2
