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1、感受态细胞(DH5， ，TOP10)操作步骤第一天1. 配制试剂 100mM CaCl2：7.35g CaCl2.2H2O /500 ml dd H2O 100mM MgCl2：10.15g MgCl2.6H2O /500 ml dd H2O 50%（V/V）甘油 1L LB 培养基（1L dd H2O+25g LB粉末） 75%（V/V）酒精配制试剂（100mM CaCl2100mM MgCl2）：称取相应质量的固体粉末将其转移到事先清洗干净的烧杯里（若有容量瓶，使用容量瓶），用超纯水清洗量筒三次，加少量dd H2O到烧杯溶解固体粉末，将烧杯里溶液加到量筒里，用少量dd H2O清洗量筒三次，
2、将量筒定容到500 ml，将溶液加到试剂瓶里，留待消毒。配制50%（V/V）甘油：用量筒量取250ml甘油，甘油较粘稠，加时要小心慢加，将量好后的甘油加到试剂瓶里。用另一个量筒量取250ml dd H2O，用少量水清洗量取甘油的量筒，最终将所有dd H2O加到试剂瓶里，留待消毒。2. 准备实验用品：1个500mL摇瓶、2个2 L摇瓶（加有锡箔纸）；3个无抗生素的LB平板（100ml dd H2O+3.7g LB粉末，可倒6-7个平板，下午1点左右做平板，所有感受态平板侧面需划两条线）；2个Kana LB平板（100ml LB加入50ul kana）；3ml巴氏吸管；1.5ml 小管（使用没有拆
3、封过的小管，不需灭菌）1ml 枪头；200ul 枪头；4个400ml 离心管（每管实际装350ml液体）。3. 灭菌锅消毒：100mM CaCl2；100mM MgCl2；50%（V/V）甘油；LB 培养基，dd H2O（若有灭菌水则不需灭）；500 ml 摇瓶；2 L摇瓶；1ml 枪头；200ul 枪头；6个100ml 离心管。灭完菌后拿到烘箱中60烘干，试剂则放到4冰箱中。4. 涂布感受态细胞平板（以DH5为例）pm 2:30-3:00戴好手套，清理干净操作台，喷洒75%酒精；将三个无抗性的LB平板放在工作台上，在底部标记上DH5及日期；倒5-8个Beads在第一个平板上，将beads倾到
4、一边，在空白处加10ul灭菌的dd H2O；第一个将LB平板，移液枪、枪头一起拿到-80冰箱那的操作台上，从冰箱迅速拿出装有感受态细胞的管子（三中感受态细胞的管子装在一个大袋子里，灰色为DH5，紫色为TOP10，管子上有标记），用枪头在管子中搅出一小冰块，将冰块加到10ul 水上，盖好平板盖子，将感受态细胞管子迅速放到-80冰箱里，整个步骤要迅速小心。回到之前操作台。平行换方向摇第一个平板，3-4min后将beads直接倒到第二个平板（beads不能倒在平板盖子上），平行换方向摇第二个平板，第三个平板操作同第二个，最后将beads倒回收集瓶。将涂布了DH5的LB瓶正放在37烘箱中10min，然
5、后将其倒置过夜培养。结果第三个平板应长出明显单菌落，且无其他杂菌污染。感受态细胞(DH5，T2A，TOP10)操作步骤第二天pm 3:30-4:001.清洁操作台，喷洒酒精。2用新的灭菌的50ml离心管量取100ml LB悬空加到500ml锥形瓶中。 从第一天的LB Agar板子上选择一菌落，用枪头挑出少许，将挑出的少许菌落细胞加入上述100ml LB中。锡箔纸封口，在37、180rpm过夜摇。3.另外两个2L摇瓶用同样方法分别加入400ml LB培养基，封口，常温下放置过夜。（以便于第二天检查是否污染，即看LB是否澄清透亮）第三天1.转菌am 7:30观察LB培养基是否污染，无污染的话用1m
6、l移液枪分别悬空转移4ml 过夜培养的菌液到400ml 的LB培养基摇瓶，操作中移液枪不可碰到摇瓶的任何部位。将摇瓶置于37、180rpm开始摇。半个小时后打开紫外分光光度计预热。一个小时后开始监测菌液的OD600，一般在两个小时左右OD600达到0.4-0.45，监测过程中遇到OD600到0.35以上时每隔5min监测一次值。2.预冷将100mM CaCl2、100mM MgCl2、50%（V/V）甘油、LB 培养基放入4冰箱预冷；将3ml巴氏吸管、1.5ml 小管、1ml 枪头、400ml 离心管、分装感受态细胞的盘子置于-20预冷；开启蛋白间的空调（若冬天无需开）、制冰机、离心机（4）预
7、冷，喷洒75%酒精在蛋白间的工作台。3.制备菌液OD600值达到0.4时，迅速将摇瓶置于冰上并转移到蛋白间，取出6个80ml离心管将其置于冰上，将菌液悬空加入到离心管中，每管加入80mL菌液，配平离心；DH5a活化细胞：7000rpm 5min T2A（ccdB survival）细胞：7000rpm 5min TOP10活化细胞：3000rpm 10min悬空倒出上清液，将离心管立即置于冰上，用50ml干净离心管量取35ml（12.5ml/50ml）预冷的100mM MgCl2溶液加入离心管中，3ml 巴氏吸管温柔悬浮菌液，此步骤在冰上操作。悬浮完全后离心；DH5a活化细胞：6000rpm
8、7min T2A（ccdB survival）细胞：6000rpm 7min TOP10活化细胞：3000rpm 14min感受态细胞(DH5，T2A，TOP10)操作步骤悬空倒出上清液，将离心管立即置于冰上，用50ml干净离心管量取30ml/35ml分批（25ml/50ml）预冷的100mM CaCl2溶液加入离心管中，巴氏吸管冰上温柔悬浮菌液。悬浮完全后，在冰盒中（放入4冰箱）放置45分钟。然后置于离心机中离心；DH5a活化细胞：7000rpm 10min T2A（ccdB survival）细胞：7000rpm 10min TOP10活化细胞：3000rpm 20min悬空倒出上清液，将
9、离心管立即置于冰上，用10ml 移液枪加入7ml（2.5ml/50ml）预冷的100mM CaCl2溶液，巴氏吸管冰上温柔悬浮菌液。悬浮完全后，在冰盒中（放入4冰箱）放置45分钟。时间到后，将细胞混合到一个50ml的新的离心管中，估算体积A（40mL），计算所需加入的50%甘油的体积X，使其终浓度为15%。计算方法：（X+A）*15%=X*50%；X17mL，故总体积大于57mL。按照此方法操作，一周可以做三批，这样可以做总体积大于171ml的感受态细胞。事先准备一个干净袋子写上DH5a/日期/CX/QC；开始分装，取出预冷的盘子置于冰上，然后取出1.5ml 管子依次排列在盘子上并打开盖子；每
10、个管子中加入500ul 感受态细胞，加完感受态细胞的小管迅速放到冰上；分装完毕后将小管装入袋子后迅速放入-80冰箱中。4.在感受态工作日志（存于电脑E盘）上填写相关信息。5.QC检测对在-80冰箱中冻了一夜的感受态细胞进行5kb和13kb的检测，步骤如下：（1）取出存于-20 Andy box的5kb、13kb质粒和存于-80的感受态细胞置于冰上；（2）.准备两个1.5ml 管子分别标记DH5a-5kb、DH5a-13kb，每个管子分装60ul 感受态细胞，加入1ul质粒混合冰上放置30min；42 45s（TOP10 30s）热激后加入150 ul LB blank ，放在37摇床上220r
11、pm孵化1h；（3）.取出两个kana LB平板，分别标上DH5a-5kb/日期，DH5a-13kb/日期，在每个平板上倒4-6个beads，将经过1h孵化的菌液加入到平板上，平行摇4-5min后倒掉珠子，将平板于37烘箱中正方10min后倒置过夜培养；（4）.第二天观察平板上菌落情况，理论上菌落数5kb100个，3kb30个，则QC通过，在装有感受态细胞的袋子上QC后面划个钩，感受态细胞制备完成。（5）无质粒转化（看是否有DNA污染）：分别做3个带抗性的LB摇管 50ml LB-Kana（加25ul kana)分装出3ml 50ml LB-Spec（加50ul Spec)分装出3ml 50ml LB-Amp （加60ul Amp) 分装出3ml （Spec和kana的加量相同，Amp加量为前者两倍）将做好的感受态细胞取出一管，分成1份（60ul/份），直接热激（42，45sDH5，T2A/30s Top10），然后加入150ulLB在37度摇床下1小时完成复苏。然后取出50ul分别加入上述配好的3组带抗性的3mlLB中过夜，看第二天LB是否浑浊。 正常情况下，LB依然清澈。 如果浑浊，则是有质粒污染。3
