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1、乳制品中L羟脯氨酸含量的测定方法1 范围 本方法为乳制品中L-羟脯氨酸的测定方法。 本方法适用于乳制品中L-羟脯氨酸的测定。3 引用标准 GB 9695.23-2008 肉与肉制品 羟脯氨酸含量测定2 术语与定义乳制品中L-羟脯氨酸含量 hydroxyproline content of foods 在本方法规定的条件下测定的L-羟脯氨酸的含量。 L-羟脯氨酸含量用质量分数表示。4 原理 用硫酸于105水解试样，释放出L-羟脯氨酸。L-羟脯氨酸经氯胺T氧化后，与对二甲胺基苯甲醛反应生成红色化合物，在波长558nm处进行比色测定。 L-羟脯氨酸存在于动物胶、骨胶原或动物的结缔组织中。水解动物蛋白
2、(HAP)（Hydrolyzedanimalprotein，中文别名：酶解胶原蛋白）中L-羟脯氨酸含量约为10%，对于乳与乳制品本身组成成分中不存在L-羟脯氨酸，但产品标准中有氮、蛋白质或氨基酸含量的规定的乳与乳制品，可通过本方法检测L-羟脯氨酸的含量并推算出动物水解蛋白的大体含量，可鉴别检验样品是否添加动物水解蛋白，以及动物水解蛋白的大体含量。通过4 试剂 如无特别说明，所用试剂均为分析纯。水为蒸馏水或去离子水，或相同纯度的水。4.1 硫酸溶液c(H2SO4)3mol/L 量取750mL水于2L的烧杯中，在搅拌下缓慢加入320mL浓硫酸（20=1.84g/mL）。冷却到室温后转移至2L容量瓶
3、中，用水定容。4.2 缓冲溶液（pH=6.8）包括下列组分：a) 26.0g一水柠檬酸（C6H8O7.H2O）；b) 14.0g氢氧化钠；c) 78.0g无水乙酸钠Na(CH3CO2)。用500mL水溶解上述试剂并转入1L的容量瓶中，加入250mL正丙醇，用水定容。该溶液于4暗处可稳定保存几周。4.3 氯胺T溶液称取1.41g三水N-氯-对甲苯磺酰胺钠盐（氯胺T），用100mL缓冲溶液（4.2）溶解。临用时配制。4.4 显色剂称取10.0g对二甲胺基苯甲醛，用35mL高氯酸溶液60%(质量分数)溶解，缓慢加入65mL异丙醇。临用前配制。若对二甲胺基苯甲醛需纯化（见8.4注），可按如下操作：用7
4、0%（体积分数）热乙醇配制对二甲胺基苯甲醛饱和溶液。依次在室温和冰箱中冷却，12h后，用布氏漏斗过滤。用少量70%（体积分数）乙醇洗涤布氏漏斗中的固体。将固体转移至三角瓶中，用70%（体积分数）热乙醇重新溶解固体，加入冷水充分搅拌，至有大量乳白色晶体析出，于冰箱中过夜。用布氏漏斗过滤固体，用50%（体积分数）乙醇洗涤后，在有五氧化二磷干燥剂的条件下进行真空干燥。4.5 L-羟脯氨酸标准溶液4.5.1 标准储备液称取50mg L-羟脯氨酸于100mL容量瓶中，用水溶解，加一滴硫酸溶液（4.1），用水定容。该溶液于4下可稳定存放1个月。4.5.2 标准工作液移取5.00mL上述标准储备液至500m
5、L容量瓶中，用水定容。分别吸取该溶液10.00mL、20.00mL、30.00mL、40.00mL于100mL容量瓶中，用水定容，所得标准工作液浓度依次为0.5g/ mL、1.0g/ mL、1.5g/ mL、2.0g/ mL。临用前配制。5 仪器和设备及材料实验室常规仪器及下列仪器、材料。5.1分析天平：感量0.0001g。5.2三角瓶：容量为100 mL，长颈，小口。5.3表面皿：直径为5cm6cm。5.4干燥箱：可控温于1051。5.5圆形滤纸：直径为12.5cm。5.6容量瓶：250 mL、100 mL。5.7比色管：25 mL。5.8铝箔或不透明塑料薄膜。5.9水浴锅：可控温于601。
6、5.10分光光度计：可用波长558nm2 nm；或使用光电比色计，其中干涉滤波器最大吸收波长为558nm2 nm。5.11比色皿：光程为1cm。6 分析步骤6.1 试样制备贮藏在冰箱中液体食品，在实验前取出并达室温。6.1.1 液态试样准确称取试样10g，精确至0.0001g，置于100 mL三角瓶中（5.2），避免试样粘在三角瓶壁上。6.1.2 固态试样准确称取均匀试样25g，精确至0.0001g，置于100 mL三角瓶中（5.2），避免试样粘在三角瓶壁上。（若加入硫酸溶液（4.1）后糊底，不能摇匀，如乳粉等试样，可准确称取均匀试样15g，精确至0.0001g，置于烧杯中，加入水搅拌均匀，并
7、定容于100mL容量瓶中。准确吸取10mL于100 mL三角瓶中，避免试样粘在三角瓶壁上。）6.2 水解6.2.1 量取30mL1 mL硫酸溶液（4.1），加入三角瓶中，用表面皿盖住，于105干燥箱内恒温16h。6.2.2 用圆形滤纸趁热将水解产物过滤至250mL容量瓶中，用10mL硫酸溶液（4.1）分三次洗涤烧瓶和滤纸，再用水洗涤，用水定容，摇匀。（注意开始过滤时滤纸和漏斗干燥无水滴）。6.2.3 用移液管移取10mL水解产物（6.2.2）至100mL容量瓶中，定容。6.3 标准曲线的绘制6.3.1 移取4.00mL不同浓度的标准工作溶液（4.5.2）于比色管中，加入2.00mL氯胺T溶液（
8、4.3），混合后于室温下放置20min1min。6.3.2 加入2.00mL显色剂（4.4）于比色管中，充分混合，用铝箔或塑料薄膜（5.8）将比色管封口。6.3.3 将比色管迅速放入60水浴中，加热20 min。6.3.4 取出比色管，用流动水迅速冷却比色管，室温下放置30 min。6.3.5 用水做参比，于558 nm2 nm处用分光光度计或光电比色计测定吸收值。6.3.6 以扣除了空白的标准工作液的吸光度为纵坐标，以相应的浓度为横坐标，绘制标准曲线。6.4 空白测试 移取4.00mL 水于比色管中，按6.3.1至6.3.5操作。若空白溶液的吸收值超过0.040，则需重新配制显色剂，如有必要
9、，需纯化二甲胺基苯甲醛（4.4）。6.5 试样的测定移取4.00mL 水解稀释溶液（6.2.3）于比色管中，按6.3.1至6.3.5操作。扣除空白溶液的吸收值（6.4），从（6.3）标准曲线查得水解产物中L-羟脯氨酸的浓度。7 计算液态试样中的L-羟脯氨酸含量按下列公式计算：V1V3C106 250100C106 0.25CX100 100 V2 m 10m m式中：X 试样中L-羟脯氨酸的含量，%；V1水解产物定容体积，mL；V2移取定容后水解产物体积，mL；V3水解产物二次定容体积，mL；C由标准曲线得到的试样溶液中L-羟脯氨酸的浓度，单位为微克每毫升（g/ mL）；m 参与水解反应的试样质量，单位为克（g）；计算结果保留至小数点后三位。8 允许差同一样品的两次测定值之差不得超过平均值的5%。1
