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1、遗传学实验指导一、实验项目1、减数分裂的观察2、果蝇唾液腺染色体的观察3、花粉母细胞涂抹制片4、分离规律5、等位基因分离的验证6、独立分配规律7、基因的连锁与交换8、有丝分裂9、石蜡切片技术10、染色体数目变异的诱发及鉴定11、显微摄影技术12、植物染色体组型分析13、细胞核内DNA的鉴定14、高等植物核DNA的简易快速提取15、外源DNA的花粉管道导入技术16、大肠杆菌E.COliDH5a感受态细胞的制备和转化二、实验项目实验一减数分裂的观察一、实验目的观察并熟悉减数分裂的全过程，以及各个时期染色体的行为和变化，为学习遗传学基本规律奠定基础。二、实验说明减数分裂是在性母细胞成熟时，配子形成过
2、程中所发生的一种特殊的有丝分裂。在性母细胞形成过程中，先由有性组织（如花药、胚珠）中的某些细胞分化为孢母细胞（2n）,以后进一步由这些孢母细胞进行两次连续的分裂，而染色体只分裂一次，结果产生四个染色体数目减半的大（小）?孢子（n）。这些孢子进一步发育为雌（雄）配子，通过雌雄配子的受精结合，新个体的染色体又恢复到与亲本相同的数目，从而保证了亲代和子代间染色体数目的恒定性。减数分裂各时期的主要特点如下：第一次分裂前期I这一时期较长，变化也较复杂，一般又分为五个时期。1 、?细线期：这是减数分裂开始时期，染色体细长如线，首尾不分，绕作一团，核仁明显，电子显微镜下观察，数目成双。2 、?偶线期：由于螺
3、旋化，染色体开始变短、变粗，同源染色体配对，出现联会，呈二价体状态是这一时期的主要特征。3 、?粗线期：配对后的染色体逐渐缩短变粗，由于各染色体是由已复制的两条染色单体通过着丝粒连接起来，故每一配对的染色体中就含有四条染色单体，又称四合体。4 、双线期：四合体继续缩短变粗，同源染色体虽因非姊妹染色单体相互排斥而分开，但由于非姊妹染色单体之间发生交换，而在同源染色体的一定区段出现交叉结。、?终变期：染色体变得更短更粗，交叉结向端部移动（端化），核仁、核膜开始消失，染色体分散在整个核内，此时观察染色体最为清楚，便于计数。中期I核仁、？核膜消失，染色体排列在赤道板上，成对染色体的着丝粒转向两极，纺锤
4、丝出现。后期I同源染色体由纺锤丝牵引着丝粒，？向两极移动，由于各染色体的着丝粒尚未分裂，每一极只分到每对同源染色体中的一个，故两个子细胞将只有半数的染色体，从而实现了染色体数目的减半（2nn）。末期I染色体移到两极后，？松开变细，形成子核，细胞质分裂，在中央由纺锤丝形成细胞板，形成二分体。第二次分裂前期n染色体又开始明显缩短，？二分染色体的两个染色单体相互散开，但仍和着丝粒连在一起，没有分开。中期n每个二分染色体又整齐地排列在各个分裂细胞的赤道板上。后期n每个二分染色体的着丝粒纵裂为二，姊妹染色单体分别移向两极。末期n拉向两极的染色单体形成新的细胞核，？同时细胞质又分为两部分。这样经过两次分裂
5、，形成四个子细胞，又叫四分体或四分孢子，每个孢子内只含有最初细胞的半数染色体，以后就开始了配子体的发育。三、？实验材料用具1 、材料玉米（2n=20）、普通小麦（2n=42）、水稻（2n=24）、黑麦（2n=14）、蚕豆（2n=12）花粉母细胞减数分裂各时期的永久制片。2 、用具显微镜、二甲苯、擦镜纸等。四、实验方法根据前述减数分裂各时期的特点，在显微镜下，先低倍后高倍寻找花粉母细胞分裂相，仔细观察，并分析确定时期，最后按显微镜下观察的实际情况绘图。五、作业绘出减数分裂各时期的图象。实验二果蝇唾液腺染色体的观察一、实验目的学习解剖果蝇三龄幼虫的唾液腺及唾液腺染色体的制片方法，观察果蝇唾液腺染色
6、体。二、实验原理果蝇的唾液腺位于幼虫前端的食道两侧和神经球附近（图2-1）。剖取果蝇唾液腺细胞进行制片观察，？可见到一个由4对染色体的着丝粒结合形成的染色中心，以及向四周伸展的5条染色体臂（X?2L、2R3L、3R）,其中第4对染色体为粒状，与染色中心密切相联，总称为唾液腺染色体（图2-2）。图养1果蝇三龄幼虫及唾液腺所it位置I三齡雄虫侧面图1唾液腺2神经节3生殖腺n三龄此虫解剖图4唾液腺5神经节6气瞥78聘肪悴9弗巢10肠图果蝇唾液腺染色体果蝇唾液腺染色体是一种典型的多线染色体。它是果蝇唾液腺细胞核内有丝分裂所致，即核内染色体中的染色线连续复制而染色体并不分裂，结果使每条染色体中的染色线可
7、多达5001000条，？长度和体积分别比其它细胞的染色体长100200倍、大10002000倍，因此也称巨型染色体。由于每条染色体的染色线在不同的区段螺旋化程度不一，因而出现一系列宽窄不同、染色深浅不一或明暗相间的横纹。不同染色体的横纹数量、形状和排列顺序是恒定的。利用这些特征不仅可以鉴别不同的染色体，还可以结合遗传实验结果进行基因定位。此外，由于其体细胞同源染色体的配对，故易于进行染色体的缺失、重复、倒位和易位的细胞学观察和研究。三、实验材料用具药品1 、材料果蝇的三龄幼虫活体。2 、用具显微镜、双筒解剖镜、培养皿、载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、吸水纸、洒精灯、火柴等。3 、药品无水洒精、冰
8、醋酸、1%醋酸洋红、生理盐水（0.7%NaCI）、1M盐酸、蒸馏水。4 、培养基采用玉米粉培养基。玉米粉培养基配方水150ml琼脂1.5g蔗糖13g玉米粉17g酵母粉1.4g丙酸1ml配制时根据各成分的配比（配制量根据所用培养瓶和实验人数而定），先取应加水量的一半，加入琼脂和蔗糖，煮沸使之充分溶解。取另一半水混和玉米粉，加热调成糊状。将上述两者混和煮沸。待稍冷后加入酵母粉及丙酸，充分调匀，最后分装到经灭菌的培养瓶中。四、实验步骤、幼虫饲养选野生型雌雄果蝇各5只，放入培养瓶中繁殖，置于1618C下饲养，当幼虫爬上瓶壁准备化蛹前，即为三龄幼虫，此时虫体肥大，便于解剖，是制备唾液腺染色体的最理想时期
9、。、唾液腺剖取选取发育良好、虫体肥大的三龄虫，置于载玻片上，加几滴0.7%生理盐水，在双筒解剖镜下左手持镊子压住虫体中后部，右手持解剖针按住头剖（即口器稍后处），轻轻向前拉动，使头部扯离虫体，从而拉出唾液腺。这时可看到一对透明微白的长形小囊，即是由单细胞层构成的唾液腺，在解剖镜下隐约可见其细胞界限，唾液腺的一侧有一条泡沫状脂肪体，可用解剖针剔除，以保证制片质量。整个剖取过程须在生理盐水中进行。1 、解离把载玻片上的幼虫其它部分除去，用吸水纸小心吸去生理盐水（注意吸水纸应离唾液腺远些，以免吸附唾液腺），加1滴1M盐酸，解离23min,使组织疏松，以便压片时细胞分散，染色体展开。2 、染色用吸水纸
10、吸去盐酸,加1滴蒸馏水轻轻冲洗后吸干,加2滴1%醋酸洋红染色1520min。3 、压片盖上盖玻片（如染液不够,可在盖玻片四周再加1滴渗入）,在酒精灯上略作加热,然后用吸水纸包被载玻片,吸干多余染色液,并用手指轻压盖玻片,再用铅笔的橡皮头或解剖针柄垂直轻敲,或进一步用拇指在盖玻片上适当用力压片,注意勿使盖玻片移动。4 、观察先在低倍镜下找到分散相好的唾液腺染色体,然后调高倍镜观察,对染色体分散、个体清楚的片子,应仔细观察染色体的横纹数量、形状和排列顺序,以便对照模式照片辨认出不同的染色体臂。五、实验作业每人制2张染色体分散、横纹清晰的临时片。实验三花粉母细胞涂抹制片一、实验目的学习并掌握花粉母细
11、胞涂抹制片的基本方法,加深对植物减数分裂的认识和理解。二、实验说明花粉母细胞涂抹制片技术是一种良好的速成制片法。它具有操作简便省时,能尽快得到植物细胞染色体的分散而清晰的图象等优点,是近代细胞学上常用的研究细胞分裂的手段。学习并掌握花粉母细胞涂抹制片技术,也是我们从事遗传育种研究的基本功之一。三、实验材料用具药品1 、材料经过固定,处于减数分裂中的玉米雄穗。载玻片、盖玻片、纱布、表面皿、吸水纸、酒精灯、2 、用具显微镜、解剖针、镊子、培养皿等。3 、药品配制（1）卡诺氏固定液配方I纯酒精（或95%酒精）3份冰醋酸1份配方n纯酒精6份氯仿3份冰醋酸1份量取45ml冰醋酸加入55ml蒸馏水中，即成
12、100ml45%的醋酸。加2g洋红粉末,?加热至沸12min并同时悬入一生锈的小铁钉,或（2）?醋酸洋红染液热至沸,移去火焰徐徐加入者等冷却后加入几滴2%铁明矾（硫酸铁铵）,过滤后贮藏于棕色瓶中备用。（注：?放入铁钉或铁明矾或氢氧化铁的45%醋酸饱和液,是使染色剂略具铁质,可以增强染色性能。）3）脱水、透明剂配方I叔丁醇法45%冰醋酸 1/2冰醋酸+1/2叔丁醇纯叔丁醇配方n正丁醇法1/295%乙醇1/2冰醋酸+正丁醇（数滴）1/295%乙醇1/2正丁醇?正丁醇（4）封片剂加拿大树胶，可用对应的叔丁醇或正丁醇稀释。四、实验方法1 、取材固定取材的时间和材料的大小必须适当，才能获得较多的花粉母细
13、胞分裂相，此外及时固定，也是观察染色体减数分裂的重要条件。（1）?取材在玉米抽雄前7至10天，即大喇叭口期，用手挤捏喇叭口下部叶鞘，在感觉松软处，以刀片划一纵向切口，剖开取出数条花序分枝观察，如先端小花苞长34mm即可取用。？时间在上午7:0010:00,气温25C30C左右，此时正是玉米花粉母细胞分裂的高峰期。（2）?固定：利用化学药剂把细胞迅速杀死，使蛋白质变性和沉淀，并尽量保持各种结构的原有状态，便于染色及染色体观察分析等细胞遗传学研究。固定方法：取样后应立即投入固定液中，即随取随浸。有芒的穗应剪去，较大的应分段固定，固定时应在低温下，一般在冰箱内固定124h。将固定后的材料用95%酒精
14、洗两次，每次10min,再经80%酒精泡洗10min至无酸味时，最后放入70%酒精中保存。、染色制片选择理想的分裂时期是染色制片成功与否的重要前提条件。玉米雄穗分枝，主茎最老，从上至下逐渐幼嫩；每一侧枝的中上部最老，由此向上向下越发幼嫩。每一侧枝小穗成对着生，无柄小穗发育略早于相邻的有柄小穗。每个小穗有两朵小花，第一小花（上部）老于第二小花（基部），每朵小花内有3个花药，第一小花的分裂最有规律，可沿侧枝连续找到各个分裂时期。先取玉米雄穗分枝置于表面皿中，加少许保存液，以防干去。用镊子取适当部位花药13个（最好同一朵花），移置载玻片上，滴一滴染液，用解剖针切断花药，并轻轻挤压，使花粉母细胞从切口
15、处散出。而后将花药壁残渣捡除干净，再搅动染液，使花粉母细胞散开。置低倍镜下初检，如花粉母细胞正处于分裂期，即可加上盖玻片，将载玻片在酒精火焰上来回烘烤几次，注意勿使染液沸腾或干燥，而后用拇指垫上吸水纸轻压盖玻片，注意不能平移。这样才能使染色体染色较深，细胞质染色较淡，两者对比明显且染色体比较分散并处于同一平面内便于观察。如果染色太浅（或太深）可在盖玻片四周稍加染液（或45%醋酸），待其渗透，再烘，再压，直至染色体明显清晰为止。2 、镜检观察确定分裂时期时应识别以下几种细胞：体细胞、花粉母细胞、四分体脱开后刚发育的幼小花粉粒以及成熟的花粉粒等。一些形态较小而且整齐均一的细胞，就是花药壁体细胞。一些形态显著较大，比前述细胞大十来倍，圆形或扁圆形，其细胞核较大，几乎充满整个细胞，就是花粉母细胞。比体细胞大但比花粉母细胞小，略呈扇形的细胞，就是从四分体脱开的小孢子或幼小花粉粒。形态较大的椭圆形、似有明亮外壳、内部较透明的细胞，就是长大的花粉粒。凡形状大小同花粉母细胞相近且范围内有似空腔的核仁，出现丝状、条状、棒状物者，即正在减数分裂的花粉母细胞，注意对这类细胞进行细致的观察分析，判断所处时期，典型的制成永久制片。、永久制片将配制好的脱水透明液、号培养皿顺序排好。将制好的临时片翻转，使盖玻
