基因工程复习总结

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1、思考题第二章 分子克隆工具酶1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。常用的工具確D则连HMJ&DNA ligasc将两 条玖上 为理性DAA方 子或片段 就化形感礪酸二酯键连接成一-建体DNA聚合酶I)NA polymerase 1題过向3端理一增加枝昔酿以填补取縫方 子上的单链 設口，即亍：弓TOA聚舍覘涪性耳：W卜陶渚性限制性核酸内切酶在1M芳子内部的特异炷的re； Lr i cl. i on endomic I碱基序于11内书节进行切窖！）儘化將妃一仆磷酸分 子初到多核甘酸建 的F-0H未嫩上多核昏脱澈酶DNA polymerase kinease反转母酶reverse trans

2、eripittse以RXA或D0链为棋械合成互补的c DNAtiiDM torminyl Deoxynucleatidy transferase将零聚物星巴肌到了缰性双證或单琏血九分子的3-川末端或1真常3-末端碱性碳直酶BAP or C1P 核酸外切酶111 exonuclease TTT 降解酶nuclease S1核酸酶险1 31nuclease Bal31Taq DNA聚合酶Taq DNA polymerase核潜核酸酶RNcise去除l）XAr RNA5 dKTP的5磷酸基团脣解DNA孑-0H来端的核昔酸理基降解单链）附或RNA,产生带亍璘酸的单孩昔酸或 寡豔核昔酸，同时也可切割孜链

3、核酸分子的单链 降解双链DXA, RNA的只及歹禾端，鬲专一性单链核昔醱能在高温（72 C ）卞的单註DM为楔板* 从亍一 ：$方向 含成新 生的互 补键脱氧核糖梭酸酶DNase内切核酋貳脚、水解单K施双徒DNA2.说明限制性内切核酸酶命名原则（举例）。条目基本原则首字母第2字母第3字母第彳字母ja更序号要点3-4个字母组成，方式咼：属名+种名+株名+序号取風若的第I于字母，且大写取种名的第1十宇母，小写 取种名的翦2个字母，小写；若种名有词头 且 已命名过内兹酶，则取词头后的第一字母代替若有株名，株名则*1乍为笫4字母 長否大b写，根据 原来的情迟而定若在同一茵株中分离了 几个限制性内切核酸

4、酶，则 抉 先后顺序宼以I、丨丨、I I I等在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。 星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型 位点。引起星星活性的因素:甘油浓度高（5%）,酶过量（100U/ml）,离子强度低（25mmol/L）, pH值过高（），或是加了有机溶剂如DMSO （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、 二甲基甲酰胺，或是用其它2价阳离子如Mn2+、Cu2+、Co2+或Zn2+代替了 Mg2+。DNA ligase和ligase有什么异同Tq DNA ligaseE * cqJ1 DNA1ig

5、ase来源T4噬菌体夫肠杆茴分子量6& 00075,000辅助因子ATPNAD1底物1. 歿链1爪A分子的粘，平端2. RNA-DKA杂和体，RNA链缺口3. 双链DNA中的单雄缺口周源互补粘端双链分子中的单链缺口应用范围广泛，效率高窄5. 连接酶的反应温度如何选择，为什么连接酶最适的反应温度应是37C，但在这一温度下粘性末端的氢键结合不稳定，因此连接 反应常采用的最佳温度一般在4-16C间，通常多选用12-16C 30分钟到16小时。6什么是Klenow酶有什么作用Klenow DNA聚合酶是从全酶中除去53外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性 和35外切活性不受影响。也称为Klenow

6、片段(Klenow frgment),或DNA聚合酶I 大片段(DNA polymerase I large fragment)。它也可以通过基因工程得到，分子量为76kDa。由于没有53外切活性，使用范围进 一步扩大。 补平3凹端，如果使用带标记的dNTP，则可对DNA进行末端标记。 抹平DNA3凸端 在3一5外切活性 通过置换反应对DNA进行末端标记 在cDNA克隆中合成第二链 随机引物标记 在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA7.如何利用工具酶来研究某一个基因内含子的存在8.哪些工具酶可以用于探针标记T4 DNA聚合酶的替代合成法标记DNA探针。反转录酶还可利用单链DNA或RNA作

7、模板合成分子探针。第三章分子克隆载体1. 基因工程载体应具备哪些特点能在宿主细胞中独立复制；有一定的选择标记，易于识别和筛选；有合适的限制酶位点，可插入一段较大的外源DNA,而不影响其本身的复制； 最好有较高的拷贝数，便于载体制备。2. 作为一个最基本的载体，它必须具备哪些功能元件能独立复制的单链或双链DNA;选择标记基因；合适的限制酶位点。3.请简要描述入噬菌体溶原状态和裂解循环的基因调控模式及其在构建载体中的作用。4.丝状噬菌体载体克隆中经常遇到哪些问题丝状噬菌体载体的优点a. 可产生单链DNA或双链DNA，分别用于不同的目的单链：为丝状噬菌体，可分泌到细胞外，用于测序或制备探针双链：为含

8、双链RF DNA存在于细菌菌落中，可供基因操作，如酶切，重组、提取、转化均 应为双链DNA。具有质粒的优点b. 丝状噬菌体所能包装的DNA长度没有一定的限制，有些噬菌体颗粒可包装比野生型丝状 噬菌体DNA长7倍的DNA。缺点a较大的外源DNA片段被克隆以后，在噬菌体扩增过程中往往不稳定，很容易发生缺失的现 象，这可能是由于感染较短的噬菌体比长的噬菌体更具竞争优势所致。b. 单链载体分子感染的细胞中往往单双链混杂,纯化某种类型的分子（尤其是双链分子）比较 费力，同时由于重组DNA容易产生缺失，培养时间不能长，故所得DNA的量有限。c重组中，经常出现一些能以两种可能方向插入的载体却仅以一种特定方向

9、插入外源DNA 片段的情况，这是因为外源DNA反向链的序列，在不同程度上干扰了载体基因间区域的功能 所致。克服“缺失”的办法a. 侵染菌应避免在液体培养基中连续继代培养b应用贮存于-70C，重组phage M13感染细菌后铺板，再从噬菌斑中央部分挑取细菌后进 行小规模培养c. 培养时间应尽可能短（通常4-8h）d. 收获噬菌体的培养液不能再做为原液继续培养（因在重组子和野生型噬菌体共培养中，野 生型具有选择优势，几代培养后可消除重组子）。第四章人工染色体载体1大容量克隆载体有哪些种类，各有何特点表4-1 5种常见髙客量克隆载体及其基本特性容量（kb）筐窥腆A导入ADNA迭30-4&ColEl衣

10、JW杆 蔺破抽提Pl70-100Pl1sacBFAC130-150Pl大肠杆1scBBAG120-300F大斶杆 箇1电備化a-览外YAC250-400ARS1&de2屯泳2.简述利用YAC克隆载体构建基因文库的原理。3.简述黏粒、YAC、BAC克隆载体、P1噬菌体载体的基本构成元件。4.黏粒载体具有哪些优缺点怎样克服其缺点黏粒的优点(1) 同时具有入噬菌体和质粒载体的特性(2) 具有高容量的克隆能力柯斯质粒的缺点a. 两个粘粒之间，当存在同源序列时，可能会发生重组，结果使克隆的外源DNA片段重排 或丢失。b. 含不同重组DNA的菌落生长速度不一。当柯斯质粒文库复制扩增时，由于不同的插入片段

11、对宿主细胞作用的情况不同，结果会出现各种外源DNA片段间的比例失调。另外不同重组 柯斯质粒的产量相差悬殊。c包装蛋白制备过程较复杂，每批包装蛋白的包装效率不稳定。而且，购买包装蛋白的费用 较高。第五章表达载体1.以大肠杆菌为例，表达载体比克隆载体多了哪些功能元件，各有什么生物学功能2. 简述利用T7噬菌体启动子的pET系列表达载体的工作原理。 3.何为穿梭载体，在遗传结构上有何特点 4.将人的某个基因在大肠杆菌中表达应注意哪些问题 5.分泌表达载体需要哪些基本元件6.什么是融合表达有什么优点第8章PCR技术及其应用- 1 简述PCR扩增的原理和过程PCR反应特点：特异性强灵敏度高简便、快速对标

12、本的纯度要求低PCR的基本原理是什么用PCR扩增时，必须预先得知什么信息的半保留复制原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。b. 至少要知道足够合成一对引物的靶DNA序列。过程:a. 变性(dena tura tion)：将模板DNA置于92-96C，使dsDNA在高温下解链成为ssDNA，且 热变性不改变其化学性质；b. 退火(annealing)：将温度降至37-72C，使引物与模板的互补区相结合；c. 延伸(ex tension)：在72C条件下，DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3 -0H端，合成 DNA。这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过20-40个循环可扩增得到大量位

13、于两条引物 之间序列的DNA片段。PCR引物有哪些基本要求在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各1 UM，即1pmol/|il，在100 Hl反应体系中 相当于6x1013个分子。如果5%用于扩增1 kb的DNA片段，可得到|ig的产物，足以用于 常规分析。引物设计要考虑的几个问题 长度：至少16 bp，通常为18-30 bp,更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高 扩增的有效性。 解链温度（Tm值）：两个引物之间的Tm值差异最好在2-5C。 避免引物内部或引物之间存在互补序列（3个碱基） G+C含量尽量控制在40%-60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧 啶的连续排列，

14、以及T在3末端的重复排列。 引物的3末端最好是G或C，但不要GC连排。 PCR技术产生污染的主要原因和预防方法污染原因：1、样本间交叉污染?2、PCR试剂污染?3、PCR扩增产物污染?4、实验室中克隆 质粒的污染?预防方法：A防止污染：试剂小量分装，吸头及EP管一次性使用；器皿及工作区域要分开；无菌操作 B、设立对照：阳性对照?阴性对照?包括：标本对照和试剂对照。 PCR技术有哪些应用 A克隆的基本原理是什么第九章DNA序列分析1. 简述化学降解法测序的基本原理以及主要应用范围。a. 原理：将待测DNA片段的5 端磷酸基团作放射性标记，再分别采用不同的化学方法对特 定碱基进行化学修饰并在该位置打断核酸链,从而产生一系列长度不一且分别以不同碱基结 尾的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过并列点样（lane-by-lane）的方式用凝胶 电泳进行分离，再经放射自显影，即可读出目的DNA的碱基序列。b. 核心原理:特定化学试剂可对不同碱基进行特异性修饰并在被修饰的碱基处（5或3） 打断磷酸二酯键,从而达到识别不同碱基种类的目的。化学降解测序法的基本步骤包括：?（1）对待测DNA片段的5端磷酸基团作放射性标记；（2）用化学修饰剂修饰特定