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1、免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧 光染色。双重免疫荧光标记法（double immunofluorescence labeling met hod）也分为直接法和间接法。冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固 定 10min ，待丙酮完全干后于 PBS （）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS （）中在脱色
2、摇床上晃动洗涤3 次，每次 5min。3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（）中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次 5min。4、加试剂1,2 :按片子数量和组织大小取tune 1试剂盒内适量试剂1（TdT） 和试剂2（dUTP）按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织， 切片平放于湿盒内，37C恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。5、BSA封闭:将玻片置于PBS（）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织室温封闭30min。6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的
3、一抗，切片平放于湿盒内 4C 孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PB（中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次 5min。 切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育 50min。8、DAPI复染细胞核：切片用PBS （）洗涤3次，每次5min。去除PBS后 在圈内滴加 DAPI 染液，避光室温孵育 10min。9、封片：玻片置于PBS （）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5mino 切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。10、镜检拍照： 切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm； FITC绿光激发波
4、长465-495nm，发 射波长 515-555nm； CY3 红光激发波长 510-560，发射波长 590nm） 石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I15-20min-二甲苯II 15-20min-无水乙醇 I lOmin-无水乙醇 II 10min-95%酒精 5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。2、修复： 切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS
5、（）中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次 5mino3、破膜： 切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS（）中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次 5mino4、加试剂1,2 :按片子数量和组织大小取tune 1试剂盒内适量试剂1（TdT） 和试剂2QUTP）按2:29混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37r恒温箱孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。5、BSA封闭:将玻片置于PBS （）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，
6、 切片平放于湿盒内 4C 孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PB（中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次 5min。 切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育 50min。8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（）洗涤3次，每次5mino去除pbs后 在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育lOmin。9、封片：玻片置于PBS（）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。10、镜检拍照： 切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm； FITC绿光激发波长465-495nm，发 射波长515-555nm； CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）1、荧光染色后一般在lh内完成观察，或于4C保存4h,时间过长，可能会使荧光提前衰退。2、每次试验均需设置以下三种对照：（1）阳性对照：阳性血清+荧光标记物;（2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物;（3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
