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1、生物化学实验指导书西安工程大学生物工程系二一一年十一月二十五日目 录实验1 蛋白质的沉淀,变性反应3实验2 蛋白质含量的测定7实验3 氨基酸的分离鉴定薄层层析法9实验4 液化淀粉酶活力测定11实验5 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法14实验6 核酸浓度测定紫外线（UV）吸收法16实验7 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳18实验8 植物中抗坏血酸含量的测定20实验1 蛋白质的沉淀,变性反应目的要求：了解蛋白质的沉淀反应,变性作用和凝固作用的原理及它们的相互关系。原 理：在水溶液中，蛋白质分子的表面，由于形成水化层和双电层而形成稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。但是，蛋白质胶体颗粒的
2、稳定性是有条件的，相对的。在一定物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应，这种反应可以分为以下两种类型。一、可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子结构并未发生显著的变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去以后，能再溶于原来的溶剂中。这种作用称为可逆沉淀反应，又叫做不变性沉淀反应，属于这一类的反应有盐析作用；在低温下，乙醇，丙酮对蛋白质的短时间作用以及利用等电点的沉淀等。二、不可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质分子结构，空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能
3、再溶于原来溶剂中的作用叫做不可逆沉淀反应。重金属盐，植物碱试剂，过酸，加热，震荡，超声波，有机溶剂等都能够使蛋白质发生不可逆沉淀反应。实验操作一、试剂1 蛋白质溶液取5mL鸡或鸭蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后用48层纱布过滤，新鲜配制。2 蛋白质氯化钠溶液取20mL蛋清，加蒸馏水200mL和饱和氯化钠溶液100mL，充分混匀后，以纱布过滤不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。饱和硫酸铵溶液，3%硝酸银，0.5%乙酸铅，浓盐酸，浓硫酸，浓硝酸，5%磺基水杨酸，0.1%硫酸铜，饱和硫酸铜溶液，0.1%乙酸，10%乙酸，饱和氯化钠溶液，10%氢氧化钠溶液。二、器材试管，试管架，滤纸，滴
4、管。三、操作1、蛋白质的可逆沉淀反应蛋白质的盐析作用用大量中性盐使蛋白质从溶液中沉淀析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。析出的蛋白质仍然保持其天然蛋白质的性质，减低盐浓度时，还能溶解。沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度不同，而盐类不同也有差异。例如：向含有清蛋白和球蛋白的鸡蛋清溶液中加入硫酸镁或氯化钠至饱和，则球蛋白沉淀析出。加硫酸铵至饱和，则清蛋白析出。另外，在等电点时，清蛋白可被饱和硫酸镁或氯化钠或半饱和的硫酸铵溶液沉淀析出。所以在不同条件下，用不同浓度的
5、盐类可将各种蛋白质从混合溶液中分别沉淀析出，该法称为蛋白质的分级盐析。目前在酶的生产和制备，科研工作和临床化验等工作中广泛应用。取一支试管加入3mL蛋白质氯化钠溶液和3mL饱和硫酸铵溶液，混匀，静置约10min，球蛋白则沉淀析出。2、蛋白质的不可逆沉淀反应（1）金属沉淀反应重金属盐类易与蛋白质结合成稳定的沉淀而析出。蛋白质在水溶液中是酸碱两性电解质，在碱性溶液中（对蛋白质的等电点而言），蛋白质分子带负电荷，能与带正电荷的金属离子结合成蛋白质盐。在有机体内，蛋白质常以其可溶性的钠盐或钾盐的形式存在，当加入汞，铅，铜，银等重金属盐时，则蛋白质形成不溶性的盐类而沉淀。经过这种处理后的蛋白质沉淀不再溶
6、解于水中，说明它已经发生变性。重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，特别是在碱金属盐类存在时。因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质；临床上的蛋白质解除重金属盐的食物性中毒。但应注意，使用乙酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时，试剂不可加过量，否则可以使沉淀出的蛋白质重新溶解。取3支试管，各加入约1mL蛋白质溶液，分别加入3%硝酸银34滴，0.5%乙酸铅13滴和0.1%硫酸铜34滴，观察沉淀的生成。向第二，三支试管再分别加入过量的乙酸铅和饱和硫酸铜溶液，观察沉淀的再溶解。a有机酸沉淀蛋白质有机酸能使蛋白质沉淀。磺基水杨酸最有效，能将血清等生物体液中的蛋白质完全除去，因此得到广泛应用。B 无机酸沉
7、淀蛋白质浓无机酸（除磷酸外）都能使蛋白质发生不可逆的沉淀反应。这种沉淀作用可能是蛋白质颗粒脱水的结果。过量的无机酸（硝酸除外）可使沉淀出的蛋白质重新溶解。临床诊断上，常利用硝酸沉淀蛋白质的反应，检查尿中的蛋白质的存在。取三支试管，分别加入浓盐酸15滴，浓硫酸，浓硝酸10滴。小心地向三支试管中，沿管壁加入蛋白质溶液6滴，不要摇动，观察各试管内两液面处有白色环状蛋白质沉淀出现。然后摇动每个试管。蛋白质应该在过量的盐酸及硫酸中溶解。在含硝酸的试管中，虽经振荡，蛋白质沉淀也不减少。(2) 加热沉淀蛋白质几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，变成不可逆的不溶状态。盐类和氢离子浓度对蛋白质加热凝固有重要影响
8、。少量盐类促进蛋白质的加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全，最迅速。在酸性或碱性溶液中，蛋白质分子带有正电荷或负电荷，虽加热蛋白质也不会凝固。若同时有足量的中性盐存在，则蛋白质可因加热而凝固。 取五支试管，编号，按下表加入有关试剂（单位：滴）管号 试剂蛋白质溶液0.1%乙酸10%乙酸 饱和NaCl 10%NaOH蒸馏水12345 10 10 10 10 10 5 55 2 2 7 2 2 5将各管混匀，观察记录各管现象后，放入沸水浴中加热10min，注意观察比较各试管的沉淀情况，解释实验结果。实验2 蛋白质含量的测定目的要求：学习双缩脲法测定蛋白质的原理和方法原理：具有两个或两个以上
9、肽键的化合物皆有双缩脲反应，此蛋白质在碱性溶液中，能与二价Cu离子形成紫色络合物，色深浅与蛋白质的浓度成正比，可用来测定蛋白质的浓度。实验操作一 测试样品1标准蛋白溶液10mg/ ml牛血清蛋白溶液（用0.05mol/L氢氧化纳溶液配制）。作为标准用的蛋白质要预先用凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其浓度称量，配制成标准溶液。 2测试样品液人（鸭）血清（稀释十倍）。测试其他蛋白样品应稀释适当倍数，使其浓度在标准曲线测试范围内。二 试剂双缩脲试剂：将0.175g硫酸铜（CuSO45H2O）溶于15mL蒸馏水，置于100mL容量瓶中，加入30mL浓氨水，30mL冰冷的蒸馏水和20mL饱和NaOH溶液，
10、摇匀，室温放置12h,再以蒸馏水定容至100mL后，摇匀，备用。三 器材试管，试管架，恒温水浴，722型分光光度计。四、操作1、绘制标准曲线取6支干试管，按下表平行操作。 0 1 2 3 4 5标准蛋白液/mL 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蛋白量/(mg) 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0蒸馏水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0双缩脲试剂/mL 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0充分混匀后,室温下(2025)放置30minA540取每组测定的A540值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,绘制标准曲线。2、样品的测定取1支试管，按下表平行操作。 0 1
11、 血清稀释液/mL 0.5蒸馏水/mL 1.0 0.5双缩脲试剂/mL 4.0 4.0充分均匀后,室温下(2025)放置30minA5403、查图通过样品的A值在标准曲线上找出对应的浓度值。实验3 氨基酸的分离鉴定薄层层析法目的要求：通过氨基酸的分离，学习薄层层析的基本原理及操作方法。原理：又称为薄板层析Thin Layer Chromatography（TLC），使用涂敷一层硅胶的玻璃板为支撑体，其流动相的移动是依靠毛细作用。色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种重要实验技术，属固液吸附色谱，兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（少到几微克，甚至0.01微克）的分离；
12、另一方面在制作薄层板时把吸附层加厚加大，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的质。将试样点在层析板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂（常称之为展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。类似于气相色谱中的分离过程，经过在两相间的多次分配平衡，试样中各组分在板上移动的距离不同而被分离。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示：Rf = d斑点/d溶剂在一定条件下某物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构，性质，溶剂系统，层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用薄层层析法分离氨基酸。实验操作一 器材层析缸
13、，支架，硅胶层析板，显色剂喷雾器。二 试剂1 展开剂每20ml乙醇和5ml水的混合物中溶解0.1g柠檬酸铵。2 氨基酸标准溶液0.5%的赖氨酸，苯丙氨酸，异亮氨酸溶液各5mL。3 显色剂0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。三 操作1.取层析滤纸（长22cm，宽14cm）一张。在层析板的一端距边缘3mm处用铅笔划一条直线，并点出4个距离相等的点。2. 点样 用毛细管将各氨基酸标准溶液和待测样品分别点在这4个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径以1.5mm左右为宜，最大不超过3mm。3. 在层析缸中加入展开剂，其量以深度不超过2mm为宜。展层 将已经点样层析的点样端向下直立于层析缸的展开剂中（展开剂的液面需低于点样线1cm）。待溶剂上升至距层析板上沿3-5mm时取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用风机热风吹干。4.显色 用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中或用热风吹干即可显出各层析斑点。5.计算各种氨基酸的Rf值，并判断待测样品中所含氨基酸种类。实验4 液化淀粉酶活力测定目的要求：学习和掌握测定淀粉酶活力的原理与方法。原理：液化淀粉酶能催化水解淀粉生成分子较小的糊精和少量的麦芽糖及葡萄糖。本实验以碘的呈色反应来测定液化型淀粉酶作用速度，从而衡量此酶活力的大小。实验操作一、
