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1、川芎嗪对小鼠化学性肝损伤的实验研究【摘要】目的研究川芎嗪(tetraethylpyrazine,TP)对小鼠化学性肝损伤的作用及其可能机制。方法采用在体和离体两种方法观察:在体以D-氨基半乳糖D-galatsaine,D-Gal诱导小鼠急性肝损伤模型,测定各组肝损伤小鼠血清谷丙转氨酶(glutaipyruvitransainase,GPT)、谷草转氨酶(glutai-xalaetitransainase;GT)活性,及肝组织丙二醛(alndialdehyde,DA)、黄嘌呤氧化酶(xanthinexidase,XD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathinperxidase,GSH-PX)、一
2、氧化氮(nitrgennxidu,N)、一氧化氮合成酶(nitrixidesynthetase,NS)、诱生型一氧化氮合酶(induiblenitrixidesynthase,iNS)含量。体外实验采用小鼠离体肝细胞原代培养,并建立l4诱导肝细胞坏死性损伤模型,检测TP对其的影响。结果TP能显著降低小鼠血清中升高的GPT，GT，降低XD活力和过氧化物终产物DA的含量。对氧化应激引起的肝脏GSH含量下降具有升高作用。TP可以显著降低离体培养中染毒肝细胞中的GPT程度。结论提示TP对小鼠化学性肝损伤具有显著的保护作用。【关键词】川芎嗪肝损伤肝原代培养细胞川芎嗪为中药川芎的有效成分，化学构造为四甲基
3、比嗪Tetraethylpyrazine，TP,被广泛应用于心脑血管闭塞性疾病的治疗1。川芎嗪有解痉、降压、扩张血管等广泛的生物作用。川芎嗪在肝细胞方面的研究尚少见报道。有研究说明2，川芎嗪能减轻大鼠肠缺血再灌注所致肝脏损伤。其机制与减少大鼠脂质过氧化,改善ATPase功能有关。本实验采用了体内给药以及建立体外模型两种方法观察TP对小鼠急性肝损伤的保护作用。在体实验主要从体内降酶和抗脂质过氧化、抑制N等方面研究TP对肝损伤的治疗作用。离体采用体外小鼠原代细胞模型,排除神经和体液因素的影响,观察TP对l4染毒的小鼠肝细胞的保护作用,进一步讨论TP及阳性对照药物的膜保护作用机制，以便为临床用药提供
4、参考。1材料与方法1.1动物昆明种小鼠,雌雄兼用,体重2124g荆门职业技术学院实验动物中心提供。1.2药品与试剂川芎嗪注射液40g/2l，北京第四制药消费，批号：202203020，D-半乳糖胺(D-Gal)，重庆医科大学提供，批号：051215，四氯化碳(l4)，分析纯,南京化学试剂一厂消费，批准文号：GB32226；生化检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所提供；刀豆蛋白A(nanavalinA,nA,Siga)；噻唑蓝(TT,Siga)；胶原酶(llagenase,475Ug-1)为Siga产品；二甲基亚砜(DS,苏州正兴化工厂)；乙二醇-双(-氨基乙基)-醚-四乙酸(HEPES)均购
5、自和光纯药药工业株式会社。1.3动物分组昆明小鼠随机分为5组,每组10只。分别为正常对照组:生理盐水20lkg-1；模型组:生理盐水20lkg-1；TP高剂量组:800lkg-1；中剂量组400lkg-1；低剂量组200lkg-1，灌胃1次/d,连续给药7d。于末次给药1h后,除正常对照组外,其他各组小鼠均腹腔注射10%D-Gla(800gkg-1)。禁食不禁水,16h后由球后静脉丛取血,别离血清备测GPT，GT。处死小鼠后,取肝称重并计算肝系数(肝脏湿重与体重之比)。1.4血清酶活性测定别离血清后用赖式改进法测GPT，GT;称取肝脏总重量,测肝重系数变化。1.5肝组织匀浆酶活性测定用考马斯亮
6、蓝法(试剂盒)测定蛋白质含量,用硫代巴比妥酸法(试剂盒)测定丙二醛(DA)含量,用紫外分光光度法(试剂盒)测定黄嘌呤氧化酶(XD)活性,用二硫双硝基苯甲酸显色法(试剂盒)测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性,用硝酸复原酶法(试剂盒)测定一氧化氮(N)。1.6肝细胞别离小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉,用70%的酒精棉球消毒小鼠体表后,背位固定。再次用酒精棉球消毒其腹部,腹正中V形切口,使腹腔充分暴露,门静脉插管并固定,向肝脏灌注37预温的前灌流液(无钙镁Hanks平衡盐溶液,内含0.5lL-1EGTA、25lL-1HEPES,pH7.4)。同时翻开后腔静脉,尽量冲尽肝组织中残血,然后翻开胸腔,剪
7、断前腔静脉,结扎后腔静脉。再用37预温的灌流液(含0.1%胶原酶、4lL-1al2，0.8lL-1gS4的HBSS)继续灌流,控制流速约6lin-1，持续灌流数分钟后,待肝组织韧性消失,轻压不易恢复,停顿灌流。立即将肝脏置于含完全培养基的培养皿中,用含10-6lL-1胰岛素和10-6lL-1地塞米松的无血清RPI-1640培养基冲洗23次后,将肝脏转入另一盛有含胰岛素和地塞米松的RPI-1640培养基的平皿中,用眼科镊去除肝包膜,轻轻抖动,分散肝细胞,将此肝细胞悬液用100目滤网过滤,滤液以50g离心2in,弃上清,沉淀为肝本质细胞(hepatytes,H)3。1.7l4致肝损伤与转氨酶的释放
8、实验在96孔培养板中参加上述别离的肝细胞,每孔细胞数为2104,于37,5%2培养4h,肝细胞单层用illiasE培养液洗涤2次,加药预培养3h,弃上清,再参加l4(0.15%)和药物共培养2h或只加l4培养2h，汲取上清测谷丙转氨酶活力4。1.8统计方法用SPSS10.0软件包处理数据。各项数据均以表示,多组计量资料均数比拟采用单因素方差分析。并进展组间两两比拟,方差齐用LSD法,方差不齐采用DunnettsT3法比拟,P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1DGLL对D-Gal所致肝损伤小鼠血清酶程度的影响与对照组相比,模型组的肝脏指数有极显著的增加(P0.01)TP高、中剂量组使升高
9、的肝脏系数极显著地降低(P0.01)。与模型组相比,TP高、中剂量组小鼠血清中GPT，GT程度均显著下降(P0.01)。结果见表1。表1TP对D-半乳糖胺所致肝损伤小鼠血清酶程度的影响(略)2.2TP对D-Gal所致肝损伤小鼠肝匀浆中DA、XD和GSH程度的影响模型组肝匀浆DA程度及XD活力与正常组相比明显升高(P0.01),TP高、中、低剂量组中,肝匀浆DA程度明显降低(P0.01)，TP高、中、低给药组动物肝匀浆中XD活力与模型组相比,明显降低；与对照组相比,模型组肝匀浆GSH程度也明显降低(P0.01),TP高、中剂量组升高肝匀浆中降低的GSH活力,TP低剂量给药组未见明显效果。结果见表
10、2。表2TP对D-半乳糖胺所致肝损伤小鼠肝匀浆中DA，XD和GSH程度的影响(略)2.3TP对D-Gal所致肝损伤小鼠肝匀浆中N，NS和iNS程度的影响模型组肝匀浆N，NS，iNS程度与正常组相比明显升高(P0.01)，TP高，中剂量组均可显著降低肝匀浆中升高的N，NS，iNS含量，TP低剂量组未见明显作用。见表3。表3TP对D-半乳糖胺所致肝损伤小鼠肝匀浆中N，NS和iNS程度的影响略2.4形态学观察对照组肝细胞形态无明显改变,细胞界限明晰。l4损伤后,肝细胞经台盼蓝染色显示,细胞活性明显降低,在显微镜下,可见细胞膜不规那么,有皱缩现象TP组及各给药组细胞形态明显好于模型组。2.5DGLL对
11、l4损伤肝细胞GPT的影响l4损伤肝细胞后,促进肝细胞内酶的释放,模型组的GPT程度较对照组明显升高。与模型组相比TP各剂量组均能显著抑制GPT程度的升高,在与上述一样的浓度下,均可剂量依赖性地降低GPT浓度。见表4。表4TP对l4损伤肝细胞ALT的影响(略)3讨论体内实验中采用D-Gal腹腔注射导致小鼠急性肝损伤,实验中模型组小鼠血清GPT，GT程度明显升高,与正常对照组比拟均有明显改变,提示本实验造成了小鼠急性肝损伤5。本实验结果说明，TP可降低产生氧自由基酶系的活力,如可降低XD活力和过氧化物终产物DA的含量。DA可间接反映机体细胞受自由基攻击的程度,显示细胞损伤的程度。同低剂量组相比高
12、剂量组降低DA的含量优于低剂量组,提示TP高、中剂量较低剂量具有更强的减轻脂质过氧化反响的作用,减轻过氧化作用对细胞膜，RNA和蛋白质等的攻击,从而改善由过氧化反响引起的肝损伤6。GSH广泛存在于人体的各种组织中。GSH程度降低意味着机体抗氧化才能下降并引发机体的氧化应激反响,因此自由基生成大量增加。从本实验可以看出,与对照组相比,模型组肝匀浆GSH程度显著降低,提示在肝脏化学性损伤时,氧化应激消耗GSH引起肝脏GSH含量下降,机体抗氧化才能下降并引发机体的氧化应激反响,因此自由基生成大量增加。TP处理后肝脏GSH之所以明显高于肝损伤组。可能与下述机制有关：减轻氧化应激的程度使其低于肝损伤模型
13、组;增强组织、细胞的抗氧化才能,减弱氧化应激反响导致的肝损伤。本实验用D-Gal致急性肝损伤后,模型组肝匀浆iNS程度与正常组相比显著升高,同时模型组肝匀浆N程度也明显升高,这些主要由iNS诱导产生的N在肝损伤中主要起毒性作用。本实验结果提示TP组显著降低肝匀浆中升高的N,从而减轻肝脏组织中高程度的N对肝组织的毒性作用,且TP高剂量组较中剂量组小鼠肝组织中N浓度进一步降低,提示TP对肝组织中N浓度降低在一定范围内与剂量呈正相关。l4中毒引起的动物GPT升高程度与肝细胞损伤程度呈平行关系7，转氨酶升高在一定程度上反映了肝细胞的损伤程度8。本实验中我们采用原代培养肝细胞的方法,建立了l4诱导肝细胞
14、坏死性损伤模型。l4染毒2h,说明l4是通过早期溶膜作用而破坏膜构造,细胞膜受损,通透性增加,细胞内GPT，K+顺浓度梯度而漏出。别离正常小鼠的H,预培养后参加不同浓度的药物共培养4h,洗去药液后参加l4共培养。结果与H的GPT自动释放值相比,l4参加后引起原代肝细胞损伤,导致H释放GPT显著增加,而TP及各组药物对l4引起的肝细胞损伤均呈现不同程度的保护作用,有明显的量效关系。提示：TP具有抗l4损伤小鼠肝细胞后的脂质过氧化作用和脂质膜稳定作用。有保护肝细胞和溶酶体膜构造作用。综上所述,TP在降酶、抗脂质过氧化、抑制细胞因子N等方面都表现出了很重要的作用。同时体外实验排除了TP通过神经和体液
15、因素所起的间接作用,从细胞程度证实TP对l4所致的肝脏损伤有一定的保护作用。【参考文献】1杨光田,李树生,邓普珍,等.实验动物复苏及缺氧时川芎嗪对心脑的作用J.中国急救医学,1997,17(1)：7.2高卉,阮明凤,白育庭，等.川芎嗪对大鼠肠缺血再灌注肝损伤保护作用的实验研究J.时珍国医国药，2022，178：1479.3uFH,aJS,JiangJY.Rusgeninglyside(L-3)islatedfrLiripeusari,iprvesliverinjurybydysfuntiningliverinfiltratinglyphytesJ.JPharPharal,2001，532：681.4KisY,Thkin,HikinH.AssayethdfrantihepattxiativityusingarbntetrahlrideinduedyttxiityinpriaryulturedhepatytesJ.Plantaed,1983，493：222.5邹丽宜，吴铁，崔燎.四氯化碳对大鼠肝毒性的时量关系研究J.中国临床药理学与治疗学,2022，268:158.6杨错,刘玉兰,张红梅.肝细胞损伤机制及防治药物研究进展J.实用药物与临床,2022，248:44.7马学惠,赵元昌,君镭,等.齐墩果酸防治实验性肝损伤作用的
