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1、MTT实验法测定细胞增殖1.实验材料 1.1. 实验细胞株 癌细胞株用含有10%新生小牛灭活血清RPMI-1640培养基，培养在37、饱和湿度、5%CO2的无菌培养箱中，每隔23天进行一次细胞传代。 1.2 药物与试剂 RPMI-1640 培养基 DMSO 胰蛋白酶粉 1-甲基乙内酰脲 5-氟尿嘧啶 MTT 粉 甘油 碘化丙啶(PI) 新生小牛血清 1.3 仪器设备 超净工作台（SW-CJ-2FD 型） 超低温电冰箱 恒温水浴箱 低温高速离心机 恒温震荡摇动床 -20电冰箱 光学显微镜 电子天平 Eppendorf 移液枪（10、100、1000ul） 去离子纯水仪 流式细胞仪 低温数控高速离
2、心机 普通离心机 1.4 主要试剂配方 1.4.1 PBS 溶液 磷酸二氢钾(KH2PO4)0.24g、氯化钠(NaCl)8.0g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.44g、氯化钾(KCl)0.2g，用去离子水(ddH2O)溶解，然后将其定容使总体积为 1.0L。再使用盐酸将 PH 值调至 7.4，用无菌盐水瓶分装好，高压消毒灭菌，4内保存。临用前要在 37水浴加热。 1.4.2 细胞培养基 称取 RIPM-1640 培养基粉 10.4g，用 1.0L ddH2O 溶解，再往溶液中加入 2g NaHCO3，再用盐酸将 PH 值调整至 7.0，采用抽滤法除菌，无菌盐水瓶分装，置于 4冰箱中保存，使
3、用前往瓶中加入灭活新生小牛血清，使每瓶培养基中灭活新生小牛血清的浓度为 10%。每次临用前要将含有 10%灭活新生小牛血清的RPMI-1640 培养基置于 37水浴箱中加热。 1.4.3 新生小牛血清 临用前，将新生小牛血清置于 56水浴中灭活 30min，之后用无菌盐水瓶分装密封，再置于-20冰箱中保存。 1.4.4 胰蛋白酶 在 100ml 的 PBS 溶液中加入胰蛋白酶粉 0.25g，置于 4冰箱中过夜，用直径为 0.22m 微孔滤膜除菌器除菌后分装、密封，置于 4冰箱中保存。 1.4.5 MTT 溶液(5mg/ml) 往 50ml 无菌 PBS 中加入 250mg MTT 粉，轻轻摇匀
4、，使 MTT 粉充分溶解，予用直径为 0.22m 微孔滤膜除菌后分装、密封，锡箔纸避光，置于 4冰箱中临时保存（7 天），置于-20冰箱中短期保存（1 月）。 1.4.6 4%多聚甲醛 称取多聚甲醛 4g 溶于 50ml 蒸馏水中，然后加热至 70左右，用玻璃棒搅拌溶液使多聚甲醛充分溶解，然后往溶液中逐滴加入浓度为 1mol/L 的 Na0H 至溶液澄清，冷却，蒸馏水定容至 100ml，用盐酸将 PH 调至 7.2，锡箔纸避光，置于 4冰箱中保存。 1.4.7 苏木精染液 蒸馏水 700ml，甘油 300ml，苏木精 5g，碘酸钠 0.5g，冰醋酸 20ml，硫酸铝钾 500g。 1.4.8
5、伊红染液 蒸馏水 100ml，伊红 0.5g，氯化钙 0.5g。 1.4.9 1-甲基乙内酰脲溶液的配制 1-甲基乙内酰脲（M）分子式为 C4H6N2O2，分子量为 114.10，纯度99.0%，吸取适量该药物，加入少量 PBS 或生理盐水（PH7.4），配制成 500 mgL-1的母液。-20保存，临用时稀释。 1.4.10 5-Fu 溶液的配制 5- 氟尿嘧啶（ 5-Fu ）分子量为 130.08 ，分子式为 C4H3FN2O2，规格为250mg/10ml，pH 值为 8.49.2，吸取适量该药物，加入少量 PBS 或生理盐水（PH7.4），配置成 100mgL的母液。-20保存，临用时稀
6、释。 2.实验方法. 2.1.细胞培养2.1.1.细胞复苏 (1)从-80冰箱迅速取出冻存人结肠癌 SW480 细胞的冻存管，然后迅速投入37水浴箱中，轻轻摇动冻存管，使冻存管内容物迅速融化，取出后用 75%酒精消毒，放入无菌操作台，在操作台中开启冻存管。用 1000ul 的移液枪吸出溶解的细胞悬液，注入离心管，同时往离心管中加入 10 倍 10%灭活新生小牛血清RPMI-1640 培养基，准备离心。 (2) 室温下，1000 rpm，离心 5min，用移液枪吸取离心管中上清液、弃去，然后用细胞培养液洗 12 次，弃去上清培养液后，加入 1ml 培养液，用吹打管轻轻吹打，使离心管底部的细胞悬于
7、培养基中，形成悬浮液。 (3)用培养液适当稀释悬浮液后，用移液枪将细胞悬液接种到 100ml 的无菌培养瓶，盖好瓶盖，将接种有人结肠癌 SW480 细胞的培养瓶放入饱和湿度、5%CO2、温度为 37培养箱中培养，24h 后更换培养液，放入培养箱中继续培养，观察细胞的生长状况，待细胞生长状态基本恢复正常后，取对数期细胞进行实验。 2.1.2.细胞传代 (1) 在普通光学显微镜下观察观察细胞的生长状况，当细胞在培养瓶贴壁面生长融合达 70%80%时，弃去培养液，然后用 PBS 液洗 12 遍。(2) (2)用 0.25%胰酶细胞消化液，于室温或 37下消化铁壁细胞数分钟，边消化边在显微镜下观察细胞
8、的形态变化，当 70%细胞的胞膜发生皱缩，细胞体积变小、细胞变圆时，往培养瓶中加入 10%灭活新生小牛血清的 RPMI-1640 培养基45ml，终止消化。 (3)用弯头吸管反复吸取瓶内培养液吹打培养瓶的细胞贴壁生长面，吹打时确保培养瓶底部各个部位都要吹打到，动作轻柔，幅度不要太大，使贴壁细胞脱落形成细胞悬液。 (4)按实验所需细胞浓度接种，分成 23 个培养瓶，置于饱和湿度、5%CO2、温度为 37培养箱中继续培养。 2.1.3.细胞收集 (1) 在室温或 37下，用 0.25%胰酶消化液消化贴壁细胞，制成细胞悬液。 (2)用移液枪将培养瓶中细胞悬液移入 10ml 离心管，常温下 1000r
9、pm，离心5min，弃去上清液，再加入 5ml PBS 洗涤 23 次。 2.1.4.细胞计数 (1) 在室温或者 37下，用胰酶消化液消化贴壁细胞，制成细胞悬液。 (2)取盖玻片、计数载玻片各一块，先用 PBS 清洗干净，再用 75%酒精反复擦拭计数载玻片和盖玻片，然后风干，盖上盖玻片，用 10ul 移液枪吸取细胞悬液 5l 由盖玻片一侧缓慢的滴入计数载玻片中，使载玻片和盖玻片之间均匀的充满细胞悬液体。 (3)在用 10物镜显微镜下，观察计数载玻片上四角计数格内所含细胞的总数X。计数原则：细胞压中线时，数上不数下，数左不数右，细胞团块合计为一个细胞。 (4)将计数所得细胞总数代入公式，得出细
10、胞密度X/4104个/ml（细胞数/毫升原液）。 2.1.5.细胞冻存 (1)选择对数期生长的细胞冻存，用浓度为 0.25%胰蛋白酶消化液把培养瓶中的贴壁细胞消化下来，把已经消化好的细胞根据细胞传代的方法收集起来，同时细胞计算，之后将收集的细胞加到离心管，1000rpm，离心 5min，去上清液。 (2)往离心管中加入冻存液，将细胞密度调整为(510)106个/ml。冻存液的配制：甘油、胎牛血清按体积比 1:9 的比例均匀混合。 (3) 将离心管中含有细胞的冻存液分装到冻存管，每个冻存管加 11.5ml含细胞液， 在 4冰箱中放置 30 分钟，转入-20的冰箱中放置 2h 后，再放入-80冰箱
11、 24h，最后转入液氮罐中保存。 2.2 MTT 比色法检测 1-甲基乙内酰脲、5-Fu 及两者联合对 SW480 细胞增值的抑制作用 2.2.1 实验分组：分为四大组：对照组（等量PBS）、1-甲基乙内酰脲组(M)、5-Fu-、 甲基乙内酰脲与5-氟尿嘧啶联合组(MFu)。 2.2.2 1-甲基乙内酰脲对 SW480 细胞的增值抑制作用 根据文献数据和预实验，将 1-甲基乙内酰脲组设八个浓度组：M0.5mgL-1、M5mgL-1、M10mgL-1、M20mgL-1、M50mgL-1、M100mgL-1、M200mgL-1、M500mgL-1。各组分别干预人结肠癌 SW480 细胞 24、48
12、、72h，MTT 法检测1-甲基乙内酰脲对 SW480 细胞增殖抑制作用。 以上实验各组设置 6 个平行孔，实验重复三次，分析比较各组细胞增殖抑制率有无统计学差异。2.2.3 检测 1-甲基乙内酰脲及 5-Fu 分别对 SW480 细胞增殖的抑制作用 根据文献数据和上述实验结果，将 1-甲基乙内酰脲和 5-Fu 各设四个浓度组。1-甲基乙内酰脲为 M 10mgL-1、M20 mgL-1、M50mgL-1、M100mgL-1四个浓度，5-Fu 为 Fu 10mgL-1、Fu20mgL-1、Fu50mgL-1、Fu100mgL-1四个浓度。1-甲基乙内酰脲和 5-Fu 各设的四个浓度组药物浓度相同
13、，有利于两者效果比较分析。根据文献数据和上述实验结果，选择各组药物干预 48 小时后，进行 MTT 法检测 1-甲基乙内酰脲、5-Fu 对 SW480 细胞增殖抑制作用。 以上实验分组中各组设置 6 个平行孔，实验重复三次，分析比较各组细胞增殖抑制率有无统计学差异。 2.2.4 检测 1-甲基乙内酰脲与 5-Fu 联合应用对 SW480 细胞增殖的抑制作用 1-甲基乙内酰脲与 5-Fu 联合用药设四个组：M10mgL-1Fu10mgL-1、M 20mgL-1Fu 20mgL-1、M50mgL-1Fu50mgL-1、M100mgL-1Fu100mgL-1。各组分别干预人结肠癌 SW480 细胞
14、48h 后，MTT 法检测各组对 SW480 细胞增殖的抑制作用，并与单独应用 5-Fu 作用效果进行比较。以上实验分组中各组设置 6 个平行孔，实验重复三次，分析比较各组对细胞增殖抑制率的影响，差异有无显著性。2.2.5 MTT比色法基本原理噻唑蓝(MTT)比色实验是实验研究中用来检测细胞生长、存活的方法之一。MTT的基本原理为在活细胞线粒体中外源性的MTT能够被细胞内的琥珀酸脱氢酶还原为一种紫蓝色且难溶于水的结晶物甲瓒，甲瓒沉积在细胞胞质中，但是死亡细胞不会出现此现象。当甲瓒遇到二甲基亚砜(MDSO)时，沉积在细胞中的甲瓒会被MDSO溶解。采用酶联免疫检测仪在490nm或570nm的波长处
15、测定甲瓒光密度值(OD值)，用来间接反映活细胞的数量。形成MTT结晶物的量与活细胞的数量成正相关。 2.2.6 实验操作步骤 (1) 接种细胞：用 0.25%胰蛋白酶消化液消化贴壁的单层培养细胞，用含 10%新生小牛血清 RPMI-1640 培养液配制成单个细胞悬液，调细胞悬液内细胞的浓度，使细胞悬液浓度为 3104个/ml，再将细胞悬液接种细胞于 96 孔培养板中，一次接种 3 个培养板，每块培养板每孔加入上述细胞悬液 180l，每孔细胞 5200个。(2) 培养细胞：将接种好的培养板置入饱和湿度、37、5%CO2培养箱中培养 4h，待细胞贴壁后，用移液枪轻轻吸取培养板中的上清液、弃去。 (3)各组的药物干预： 按照实验方案，各组药物按方案浓度加入已接种 SW480 细胞的培养板中。于 37、5%CO2、饱和湿度培养箱中继续培养。 (4)呈色：分别在培养箱中培养到研究方案确定的时间后，往 96 孔板每孔中加入 20l 5 mgL-1 MTT 溶液，继续置于 37、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养
