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1、质粒转染大肠杆菌材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCI , NaOH （调pH）,氨苄青霉素，卡那 霉素，质粒提取试剂盒仪器：高压灭菌锅，42弋恒温水浴锅，恒温摇床（37弋,225中口），无菌培养板，消毒1.5ml离心管，消毒枪头，无菌操作台实验步骤：1. LB 培养基的配制：在 950 ml 去离子水中加入: 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 摇 动容器直至溶质溶解用5moI/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L在15psi高 压下蒸汽灭菌 20min.固态培养基LB 固体培养基及倒板 ：（1）配制：100mILB培养基加入1.5g琼脂粉（2）抗生素
2、的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55弋的水浴中，待培 养基温度降到55弋时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为50pg/mI），以免温度过 高导致抗生素失效，并充分摇匀。（3 ）倒板:一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后扌丁开盖子，在紫外下照10-15 分钟。（4） 保存：用封口胶封边，并倒置放于4弋保存，一个月内使用。2. 从-70弋冰箱中取200pI感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。3. 加入质粒DNA溶液（含量不超过50ng,体积不超过10pI），轻轻摇匀，冰上放置30 分钟后。4. 42C水浴中热击45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。5
3、. 向管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp，混匀后37C振荡培养1小时，使细菌恢 复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。6将上述菌液摇匀后取100pl涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌 液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37C培养16-24小时。同时做两个对照：对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组正常情 况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2 :以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5pl菌液涂布于不 含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。大肠杆菌的扩增1. 从LB平板上挑取新活
4、化的单个菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37C下振荡 培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1：100-1：50的比例接种 于100ml LB液体培养基中，37C振荡培养2-3小时至OD600二0.5左右。2. 取上述培养液置于冰中10min，之后转移到已灭菌的50ml离心管中再于冰上放置 5min3. 于4C离心，2700rmp , 10min，弃上清，收集细菌4. 质粒的提取准备大肠杆菌质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液5. 质粒鉴定（琼脂糖凝胶电泳）质粒转染细胞株材料细胞株、质粒、培养基、链霉素/青霉素(双抗)、FCS (小牛血清)、PBS (磷酸盐缓冲溶液)、胰
5、酶/EDTA消化液、转染试剂(Lipofectamine TM2000 )实验步骤1准备细胞：贴壁细胞：转染前24 h,在500 pL无双抗完全培养基中接种0.5-2x105个细胞， 转染时细胞融合度为80 - 90%。(注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞 堆积生长。)II .对于每个转染样品，按下面的方法准备：(1 )用50 pL Opti -MEM稀释0.8 pg质粒DNA，轻轻吹吸3 - 5次混匀，室温下 静置5 min。(2 )轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50 pL Opti -MEM稀释2.0 pL LipofectamineTM2000，轻轻吹吸3 - 5次混匀，室温下静置5
6、min。( 3 )混合转染试剂和质粒 DNA 稀释液，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 20 min。注：转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染。(4 )转染复合物加入到24孑仏田胞板中,100 pL/孔,前后轻摇细胞板混合均匀。(5 )将细胞板置于37弋、5% CO2培养箱中培养6 h左右，进行换液，换成含10% 血清的普通培养基，在37弋，5%CO2孵育箱中继续培养24h左右。稳定转染细胞株的筛选(各种细胞用什么抗生素筛选呢)从37弋，5%CO2孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用PBS冲洗细胞2遍，胰蛋白酶消化，接种1/2的细胞到100 mm培养皿中，加入含
7、500 pg/ml G418的新鲜培养基,每 2-3 天更换一次新的筛选培养基,每天观察细胞的死亡情况。当正常细胞完全死亡后，换用新的不含G418的培养基培养。每天观察细胞生长状态。在细胞达到60% 汇合率时再用含500卩g/ml G418的培养基筛选一次。当细胞达到90%以上汇合率时将细 胞转移至培养瓶中继续培养（转染后10-12天左右）以后每隔4-5天再用含500卩g/ml G418的培养基筛选。直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样品（约转染后15天左右）以后继续培养时加入的G418浓度降一半。广州然科生物科技有限公司WK Guangzhou Ranke Biotech Ccl丄td.联系方式：联系人:李经理手机：159 0204 0850邮箱：anlcmail.仁omQQ : 1046485526扫一扫，有福利网址：www.rankebio,com
